Білково-експресуючі вектори

Білкова експресія

ПЛР-реакція: ампліфікація

ПЛР-реакція: відпал праймерів

ПЦР машини

Два різних типа машин ПЛР показано на цьому зображенні. Обидва мають можливість швидко і точно змінювати температури реакції між 48 і 96 спеціально розроблених tubes .

Матриця розчинилися в два ланцюга від високої температури > 90 ° C

Відпал праймерів для обох ланцюгів

Полімераза створює копію обох ланцюгів

У реакції ПЛР, дволанцюжкова ДНК-матриця спочатку розплавляється, або денатурує, на два ланцюга шляхом нагрівання лунок до температури вище 90 градусів за цельсієм. Потім температура зменшується настільки, що прямий і зворотний праймери можуть відпалюватися. Ідеальна температура відпалу залежить від G + C вмісту праймерів. Потім температура підвищується до 70 градусів цельсія, з тим щоб термостабільні полімерази продовжували праймери.

Температура підвищується до розплаву новосинтезованої ДНК

Праймери готові до відпалу, коли температура падає

Полімераза подовжує новий ланцюг ДНК

Процес повторюється

Експонентний ріст ДНК

На цьому етапі, знову утворюються дволанцюгові ДНК-матриці. Якщо вихідна матриця була більшою, ніж в регіоні ампліфікації, то в першому етапі знову утворена дволанцюговаДНК матиме один кінець, що більше, ніж хотілося б. Потім процес повторюється: при підвищенні температури, щоб плавити новосинтезовані ДНК. ріст в ДНК. Ось чому ПЛР може бути використаний для ампліфікації ДНК з невеликого зразка крові або трохи тканини, знайдені в древніх кістках.

Важлива для протеоміки

Потрібна велика кількості рекомбінантних білків для наступних цілей:

- структури визначення

- виробництва антитіл

- білкових чіпів

Білки, зроблені в бактеріях, дріжджах і клітинах комах

Очистиска рекомбінантних білків від інших білків

Для протеомного аналізу, часто необхідно мати велику кількість рекомбінантного білка. Наприклад, кристалографічні та NMR структури білка визначення вимагає виробництва й очищення до мкг масштабах кількісті білка. Рекомбінантний білок також використовується для виробництва антитіл і білкових чіпів . Є кілька добре вивчених систем для створення рекомбінантних білків, в тому числі бактерії, дріжджі і клітини комах. Після того, як клітини накопичують рекомбінантний білок, він повинен бути очищений від інших білків, що виявлені в клітині.

Білково-експресуючі вектори мають наступне:

- індуковані промотори

- Теги для очищення

---гістидини

---епітопи

---білки

Кодуючі послідовності вставляються в рамку

Через накопичення чужорідних білків можуть бути токсичні, більшість векторів експресії білка мають індуковані промотори. Промотери дозволяють клітинам ділитися і розмножуватися без чужорідного білка. Коли клітини досягли високої щільності, рекомбінантні білки можуть бути індуковані і зібрані. Щоб допомогти в очищенні, більшість векторів експресії містять ряд амінокислот, які додають в білок. Ця додаткова послідовність білка відома як теги і відіграє важливу роль в очищенні рекомбінантного білка. Існують різні типи тегів, що використовуються в білкових експресуючих векторах. Популярні теги включають ряд гістидину відомого як His-тег, який буде зв'язуватися з колонками нікелю, епітопи, які можуть визначати моноклональні антитіла, такі як Myc, і теги, що містять білки, такі як мальтоза-зв'язуючий білок, який може бути очищають, пропускаючи через колонку цукор мальтози. Одна з причин для різних тегів в тому, що різні мітки можуть змінити розчинність рекомбінантного білка по-різному. Для тегів, щоб стати частиною рекомбінантних білків, кодуюча послідовність повинна бути вставлена в рамку з ним.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Полімеразно ланцюгова реакція	\|	Фізичне забруднення - відхилення від норми фізичних параметрів довкілля.

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.