Детекція послідовності

Реакція секвенування

Секвенування

Всі великі проекти секвенування використовують метод Сенгера

На підставі дії ДНК-полімерази

- потрібна ДНК-матриця і праймери

- полімераза і нуклеотиди

Полімераза додає нуклеотиди у відповідності до матриці

Включено невелику кількість нуклеотидних аналогів

--зупинка синтезу

Нобелівські премії були присуджені за два різних метода визначення послідовності ДНК. Метод, розроблений Максом і Гілбертом використовує хімічні засоби розривання ланцюгів ДНК в певних основах. Він потужним і точним, але цей метод вимагає використання токсичних хімічних речовин. Метод, розроблений Фредом Сенгером використовує фермент, відповідальний за реплікацію ДНК, ДНК-полімеразу. Завдяки своїй простоті, всі великі проекти секвенування сьогодні використовують метод Сенгера. Для подовженого ДНК, ДНК-полімераза потребує ДНК-матриці і праймерів. Вона також потребує вільних нуклеотидів. При відповідній температурі і концентрації солі, ДНК-полімераза буде додати відповідні нуклеотидні навпроти матричної основи. Нуклеотиди додані у відповідності з додатковими правилами розробленими Уотсон і Крик: А протилежний T, C протилежної G, і навпаки для обох пар. Для проведення реакції секвенування, невелика кількість нуклеотидних аналогів додається. Коли включений в зростаючий ланцюг ДНК, нуклеотидна аналогія - синтез зупиняється, тому що ДНК-полімераза не може додати ще одну основу в аналогічну.

Метод ланцюгової термінації ( зупинки)

- використовуються дидезоксі нуклеотиди

При додаванні потрібної кількості – ланцюг зупиняється

- кожен раз коли основа прикріпляеться до матриці

Потрібна реакція для кожної основи: A, T, C і G.

На завершення метод зупинки ланцюга Сенгер, нуклеотидні аналоги називаються дидеоксінуклеотидами. При правильній кількості додають у розчин, ланцюг буде зупинено при наявності комплементарних нуклеотидів в матриці. Наприклад, якщо потрібну кількість дидезоксі А додається, то ланцюг буде зупинено в кожному випадку Т в матриці. Щоб визначити повну послідовність потрібні окремі реакції для кожної з чотирьох основ A, T, C і G.

Детекція продуктів реакції секвенування

Включення мічених нуклеотидів

Раніше використовувалися радіактивні мітки

Тепер використовуються флуоресцентні мітки

Використовуються різні флуоресцентні мітки для кожного нуклеотида

Можуть працювати всі чотири основи в тій же смузі

Коли реакція секвенування завершується, дослідник повинен ідентифікувати новосинтезовані ланцюги. Це може бути зроблено за допомогою радіоактивно мічених нуклеотидів в реакції. В якості альтернативи, автоматизовані секвенатори на сьогоднішній сьогоднішній всі використовують флуоресцентні мітки. Кожна з чотирьох реакцій секвенування (для A, T, C і G, відповідно) використовує інший колір флуоресцентної мітки. Після того, як реакція завершена, чотири флуоресцентно мічені реакції можуть бути об'єднані і працюють в одній смузі гелю або капілярній трубці.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Побудова контінгів шляхом зонтування з кінців фрагментів	\|	Послідовність читання флуоресцентно мічених реакцій

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.004 сек.