Преципітація вірусів (осадження).

Віруси, як інші білки, можуть бути очищені шляхом преципітації з концентрованим розчином сульфату амонію. Спочатку видаляються забруднюючі речовини, потім осаджуються віруси і збираються центрифугуванням. Віруси, чутливі до сульфату амонію, очищуються поліетиленгліколем.

3. Денатурація забруднюючих речовин.

Віруси денатуруються складніше, ніж інші нормальні компоненти клітини. Контамінанти можна зруйнувати та осадити температурою або зміною рН. Оскільки деякі віруси стійкі до таких органічних розчинників, як бутанол і хлороформ, ними можна осадити контамінанти і ліпіди та відокремити віруси.

4. Ферментативна обробка клітинного вмісту.

Клітинні білки і нуклеїнові кислоти можна відокремити від вірусних препаратів шляхом їх обробки відповідними ферментами, оскільки віруси менш чутливі до обробки нуклеазами і протеазами, ніж вільні нуклеїнові кислоти і білки. Наприклад, рибонуклеаза та трипсин завжди руйнують клітинну РНК та білки, залишаючи неушкодженим віріон.

Підрахувати кількість вірусів у взірці можна наступними методами.

1. Підрахування безпосередньо в електронному мікроскопі.

Вірусний взірець змішується з невеликими латексними кульками відомої концентрації і наноситься на спеціальну пластинку. Потім безпосередньо вираховується концентрація вірусів, виходячи з концентрації латексних кульок.

2. Визначення гемаглютинації – більш розповсюджений непрямий метод.

Віруси можуть прикріплюватись до поверхні еритроцитів – червоних кров’яних тілець. Коли кількість вірусів на поверхні достатньо велика, вірусні частинки склеюють еритроцити разом, спричиняючи аглютинацію.

Титр гемаглютинації – це найбільше розведення вірусу, яке ще спричиняє гемаглютинацію. Таким чином якісно і швидко визначають вірус грипу.

3. Визначення кількості бляшок, утворених в результаті розмноження вірусних частинок на агарі в чашці Петрі на відповідних клітинах. Цей метод не дає точної кількості віріонів у мілілітрі, але дозволяє підрахувати кількість «бляшко-формуючих одиниць» (plague-forming units - PFU):

0,10 мл 10⁶ розчину вірусного препарату викликало утворення 75 бляшок, то

PFU/мл = (75 PFU/ 0,10 мл) (10⁶) = 7,5 ∙ 10⁸

4. Визначення інфекційної (ІД₅₀) або летальної (ЛД₅₀) дози

Організми (рослини, тварини) або культури клітин інфікуються серіями концентрацій вірусів. Визначається розведення, при якому захворювання (ІД₅₀) або смерть (ЛД₅₀) викликається у 50% організмів або клітин.

СТРУКТУРА ВІРУСІВ

Вивчення морфології вірусів стало можливим завдяки застосуванню електронної мікроскопії, дифракції х-променями, біохімічного аналізу, імунологічних методів тощо.

Розміри вірусів коливаються від 10 до 300 нм (табл.1). Найменші віруси не набагато більше, ніж рибосоми; найбільші (вірус коров’ячої віспи) приблизно такого розміру, як і найменші бактерії, їх можна розглянути в світловий мікроскоп.

Таблиця 1

Представники Розміри, нм

Вірус натуральної віспи 300 х 250

Вірус герпесу 100 - 150

Вірус поліомієліту 17 - 30

Форма вірусів різна: паличкоподібна, нитчаста, сферична, кубічна, булавоподібна.

Вірусна частинка називається віріоном.Вонаскладається з нуклеїнові кислоти, яка оточена білковою оболонкою. Ця білкова оболонка називається капсидом. Разом НК і капсид утворюють нуклеокапсид.

Існують 4 загальних морфологічних типи капсидів:

1. Спіральні. Виглядають як порожнисті білкові циліндри, можуть бути ригідними (жорсткими) або еластичними. Розрізняють паличкоподібні (у ВТМ, крок спіралі 2,3 нм) і ниткоподібні (у x,y,s – вірусів картоплі, жовтухи буряка, крок спіралі 3,3-3,7 нм).

2. Кубічні – тетраедри, октаедри, ікосаедри (мають 20 граней, здаються сферичними). Такі капсиди є у вірусів рослин, герпесу, аденовірусів, вірусів ящуру, поліомієліту тощо.

3. Змішана (комбінована) симетрія. Складні віруси мають змішаний тип симетрії. Вони можуть мати хвости, а також багатошарові структури навколо НК. Представники: віруси грипу, чуми птахів, віспи.

Капсиди складаються з одного або декількох типів білкових субодиниць – протомерів (капсомерів). Цікаво відзначити, що вірусний генетичний матеріал використовується з надзвичайною ефективністю. Синтез 1 протомеру в 158 амінокислот кодується 474 нуклеотидами. Протомери простих вірусів збираються шляхом самозборки, для зборки комплексних вірусів потребуються спеціальні фактори.

НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ

Нуклеїнова кислота представлена або ДНК, або РНК, причому можливі такі варіанти:

· Одноланцюгова ДНК (single-stranded DNA, ss)

· Дволанцюгова ДНК (double-stranded DNA, ds)

· Одноланцюгова РНК

· Дволанцюгова РНК

Всі ці типи знайдені у вірусів тварин (рис.1).

Рис. 1. Представники ДНК- та РНК-вмісних вірусів.

Віруси рослин містять в основному одноланцюгову РНК.

Бактеріофаги можуть мати односпіральну РНК або ДНК, однак в більшості випадків віруси бактерій містять двоспіральну ДНК.

Розміри вірусних геномів також різноманітні. Найменший геном у MS 2, Q β вірусів – 1 х 10⁶ Да, він трішки більший, ніж необхідний для кодування 3-4 білків. З іншого боку, у Т-парних бактеріофагів, герпесовірусу і вірусу коров’ячої віспи геном має розміри 1-1,6 х 10⁸ Да і може відповідати за синтез більше, ніж 100 білків.

Крихітна ДНК бактеріофагів φх 174, М 13 або парвовірусів має одноланцюгову ДНК, вона може бути у лінійному вигляді або замкнена в кільце.

Більшість вірусів мають подвійну спіраль ДНК. У деяких вона лінійна, у деяких – замкнена в кільце. Замиканню сприяє наявність «липких кінців» - сегментів на 5’ і 3’-кінцях в 12 нуклеотидів, які комплементарні:

GGGCGGCGACCT_____/ /______

_____/ /______CCCGCCGCTGGA

Крім нормальних нуклеотидів у ДНК вірусів містяться унікальні нуклеотиди. Замість цитозину у багатьох фагів виявлено 5-гідроксіметилцитозин, а у деяких – 5-метилцитозин. Тимін у ДНК фагів, що лізують B.subtilis, повністю заміщений на 5-гідроксиметилурацил. Часто до гідроксиметилової групи приєднана глюкоза, вона надає ДНК стабільності і нечутливості до ДНК-ази. Врахування цих хімічних особливостей зробило можливим вивчення процесу репродукції вірусів у клітинах господаря.

У більшості РНК-ових вірусів генетичний матеріал представлений одноланцюговою РНК. У випадку, коли послідовність нуклеотидів вірусної РНК ідентична вірусній мРНК, то такий ланцюг називається (+) РНК.

Коли вірусна РНК комплементарна вірусній мРНК, то вона називається (-) РНК.

Деякі з вірусних геномів сегментовані (розділені на декілька частин). Однак, для успішної репродукції не потрібна наявність всіх сегментів у віріоні.

(+) РНК має спільні риси з мРНК не тільки в послідовності нуклеотидів. Так само, як і еукаріотна мРНК зазвичай має на 5’-кінці «сар»(шапку, кепку) з 5-метилгуанозином, так геноми багатьох фітопатогенних і зоопатогенних вірусів теж мають «сар».

Всі (+) РНК тваринних вірусів мають на 3’-кінці поліА – послідовність, так само, як і еукаріотна мРНК. Таким чином, одноланцюгова (+) РНК може керувати синтезом білка в клітині господаря одразу після проникнення в клітину.

Як це не дивно, велика кількість одноланцюгових РНК рослинних вірусів мають 3’-кінці, які ідентичні еукаріотним тРНК, геном ВТМ також здатний приєднувати амінокислоти.

Деякі віруси мають двоспіральну РНК. У всіх випадках ця РНК сегментована, у реовірусів, наприклад, є 10-12 сегментів. Вона стабільніша, ніж двоспіральна ДНК, стійкіша до панкреатичної РНК-ази.

ВІРУСНІ ОБОЛОНКИ І ФЕРМЕНТИ

Більшість тваринних вірусів, деякі фітовіруси та один бактеріофаг оточені зовнішньою мембраною, яка називається оболонкою. Оболонка зоопатогенних вірусів походить з нуклеолеми або цитоплазматичної мембрани. Її ліпіди і вуглеводи входять до складу клітини господаря. Білки ж вірусної оболонки кодуються вірусним геномом. Вони можуть виступати над поверхнею оболонки у вигляді шипів. Ці шипи приймають участь у приєднанні вірусу до клітини господаря (наприклад, нейрамінідаза та гемаглютинін у вірусу грипу). Оскільки білкові шипи відрізняються у різних вірусів, то можуть бути використані для їх ідентифікації.

У складних віріонів є основні (гістоноподібні) білки, так звані «внутрішні» білки, які розташовуються під оболонкою і зв’язані з НК.

У вірусів, особливо у вірусів тварин, було виявлено ряд ферментів, зв’язаних з капсидом. Частина з них приймає участь у реплікації нуклеїнової кислоти.

ОКРЕМІ ПРЕДСТАВНИКИ ВІРУСІВ

Вірус тютюнової мозаїки. Має спіральну симетрію. ВТМ – це палички завтовшки 18 нм і довжиною 300 нм. Нуклеокапсид ВТМ складається з 2300 капсомерів. Вони розташовані гвинтоподібно і утворюють порожнистий циліндр (рис.2). Кожний капсомер складається з одного поліпептидного ланцюга по 158 амінокислот. У стінці порожнистого циліндру між капсомерами гвинтоподібно розташована одноланцюгова РНК.

Рис. 2. Схематичне зображення та електронномікроскопічна фотографія ВТМ.

Віруси грипу (А, В, С). Вірус групи А викликає захворювання у людей, птахів, ссавців. Він був причиною ряду великих пандемій в історії людства (1889, 1918, 1957, 1968, 1977 рр.). Віруси групи В і С викликає захворювання лише у людини. Назву хвороби дав Бруссе у XVIII ст. «Гриппе» (від франц.) – схопити, «інфлюенса» (від італ.) – вплив холоду.

Вірус грипу сферичної форми, діаметр 80-120 нм (рис.3). Оболонка вірусу – суперкапсид – має шипи глікопротеїнової природи. Шипи виступають на 10 нм від поверхні віріону, відстань між ними 7-8 нм. Одні шипи представлені ферментом нейрамінідазою, яка полегшує проникнення вірусу через мукоровий шар епітелію дихальних шляхів.

Інші шипи представлені гемаглютиніном, який викликає зв’язування віріонів з еритроцитами – гемаглютинацію. Гемаглютиніни, можливо, приймають участь у прикріпленні віріону до клітин господаря.

У вірусів групи А виявлено 13 типів гемаглютинінів і 10 типів нейрамінідаз.

Рис. 3. Будова вірусу грипу: 1 – ліпідний бішар, 2 – нейрамінідаза, 3 – гемаглютинін, 4 – рибонуклеопротеїн, 5 – матриксний білок.

Геном вірусу грипу складається з 8 фрагментів сегментованої (-) РНК і білків, утворюючи рибонуклеопротеїн. До білків відносяться РВ 1 – транскриптаза (забезпечує транскрипцію вірусної РНК), РВ 2 – ендонуклеаза (розщеплює нуклеїнову кислоту зсередини), РА – репліказа.

Нуклеокапсид оточений матриксним білком. Біліпідний шар забезпечує злиття з мембранами клітин господаря.

Завдяки такій складній будові вірусу грипу притаманна значна мінливість. На даний час практично неможливо створити ефективну вакцину проти цього захворювання. Більш того, спостерігається активна міжвидова міграція вірусу грипу, його антигенний «дрейф» і стрибок («шифт»). Наприклад, під час значних епідемій грипу людини вірус А2 виділяється від свиней, коней, великої рогатої худоби, птахів і собак тощо.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
	\|	Питання 1. Пристрої прослухування приміщень

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.005 сек.