Виявлення послідовності

Секвенування методом «обриву ланцюгів» Chain-termination sequencing

ДНК секвенування

Більшість сучасних проектів секвенування використовують метод обриву ланцюгів

- Також відомий як Сенгер секвенівання, в честь його винахідника

В основі діє ДНК-полімераза

- додає нуклеотиди в комплементарний ланцюг

Потрібні ДНК-матриця і праймери

Наймасштабніші проекти секвенування використовують метод обриву ланцюгів, який також відомий як Сенгер секвенування, після того, як Фред Сенгер, який виграв свою другу Нобелівську премію за винахід процесу. Секвенування обриву ланцюгів основане на дії ДНК-полімерази, яка додає нуклеотиди, які є доповненням до іншого ланцюга ДНК. Для того щоб він працював, потрібна ДНК-матриця , що може копіюватися, а також коротка ділянка ДНК, відома як праймер, до якого він можуть додаватися нуклеотиди.

Дидезоксирибонуклеотиди зупиняють синтез

-обривають ланцюг

Наявні в таких кількостях, щоб припинити всякий раз, коли основа з'явиться в зразку

Використовується чотири реакції

- Один для кожної основи: A, C, G, та T

У методі Сенгера ланцюгового обривання , нуклеотидні аналоги називається дидезоксірибонуклеотидами. При правильній кількості додають у розчин, ланцюг буде припинено в кожному випадку комплементарних нуклеотидів в шаблоні. Причиною цієї реакції є те, що ДНК-полімераза не може додати ще один нуклеотиду до дидезоксінуклеотиду. Наприклад, якщо потрібна кількість дидезоксі А додається, то ланцюг буде припинено в кожному випадку Т в шаблоні. Визначення повної послідовності вимагає окремої реакції для кожної з чотирьох основ A, T, C і G. На верхній правій частині слайда матричний ланцюг, а під ним знаходяться різні ланцюги, які буде припинено з дидезоксі А в реакційній суміші.

Виявлення продуктів реакції секвенування

Включення мічених нуклеотидів

Раніше використовувалися радіоактивні мітки

Тепер флуоресцентні мітки

Використовуються різні флуоресцентні мітки для кожного нуклеотида

Можуть працювати всі чотири реакції в тій же смузі

Після завершення реакції секвенування , людина повинна бути в змозі виявити ланцюги породжених реакції. Це може бути зроблено за допомогою радіоактивного ланцюга з використанням радіоактивно мічених нуклеотидів в реакції. В якості альтернативи, автоматизовані секвенсори сьогоднішній день всі використовують флуоресцентні мітки. При такому підході кожна з чотирьох послідовність реакцій (для кожної з основ A, T, C і G) використовує інший колір флуоресцентної мітки. Після того, як реакція завершена, чотири флуоресцентно мічені реакції можуть бути об'єднані і працюють в одній смуги гелю або капілярній трубці.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Розрізання ВАС резтрикційними ферментами	\|	Полімеразно ланцюгова реакція

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.005 сек.