Студопедия
Контакти
 


Тлумачний словник

Реклама: Настойка восковой моли




Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів

Мікроорганізми і віруси дуже малі за своїми розмірами, так що побачити їх неозброєним оком неможливо. В той же час морфологія мікробів, їх розміри, форма, взаємне розташування клітин, наявність чи відсутність джгутиків, внутрішня ультраструктура є дуже важливою їх характеристикою і часто служить основою класифікації. Зважаючи на це, одним з найважливіших методів дослідження будови мікроорганізмів є мікроскопія. В основі сучасних мікроскопічних методів дослідження лежить світлова мікроскопія з численними її різновидами, такими як темнопольна, фазовоконтрастна, аноптральна, поляризаційна, інтерференційна, люмінесцентна та ін. При вивченні анатомії й ультраструктури вірусів використовують електронну мікроскопію.

Сучасна промисловість випускає багато видів мікроскопів залежно від їх призначення. У практичній роботі рутинних баклабораторій найчастіше користуються мікроскопами МБР-1, МБР-3.

Мікроскоп складається з механічної, оптичної й освітлювальної частин. До механічної входять штатив, тубус, револьвер, предметний столик, макро- й мікрогвинт, до оптичної — об'єктиви й окуляри, до освітлювальної — дзеркало й конденсор.


У верхній частині штатива є тубус, у який вставляється окуляр, а знизу він має револьвер, в отвори якого вгвинчені 3-4 об’єктиви. Обертаючи револьвер, можна встановити будь-який об’єктив під отвір тубуса. Останній підіймається і опускається за допомогою макро- й мікрометричного гвинтів. Для грубого наведення зображення користуються макрогвинтом. Більш точно це робиться за допомогою мікрогвинта. Мікрометричний гвинт є однією з найбільш тендітних частин мікроскопа й вимагає обережного поводження з ним.

 

 

Предметницй столик має круглу або прямокутну форму. В його центрі знаходиться отвір, над яким вміщують предметне скло з препаратом (мазком). У більш досконалих мікроскопах є дуже зручні предметні столики, які за допомогою спеціальних пристроїв переміщують предметне скло у двох взаємно перпендикулярних напрямах.

Найціннішою частиною мікроскопа є об’єктиви, які складаються з кількох лінз у загальній металевій оправі. Об’єктиви поділяються на сухі (х8, х40) та імерсійні (х90 х120). Сухими називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою яких і предметним склом знаходиться повітря. При цьому, в зв’язку з різницею показників заломлення скла й повітря (відповідно 1,52 і 1,0), частина світлових променів не потрапляє в око мікроскопіста. Імерсійними називають такі об’єктиви, між фронтальною лінзою яких і досліджуваним об’єктом знаходиться кедрова, персикова олія чи "імерсіол", коефіцієнт заломлення світла яких такий самий, як і в скла. При дослідженні морфології мікроорганізмів користуються переважно імерсійними об’єктивами, які часто називають імерсійною системою.



Интернет реклама УБС

Найважливішою характеристикою будь-якого об’єктива є його роздільна здатність. Це та найменша відстань між двома точками, при якій вони ще видимі роздільно, тобто не зливаються в одну. Роздільна здатність об’єктива обмежена такими явищами, як хроматична й сферична аберації, дифракція та ін. Якщо обидва види аберації можна усунути, то явище дифракції існує в будь-якій оптичній системі і його усунути або, принаймі, зменшити практично неможливо. Дифракція в значній мірі обмежує роздільну здатність мікроскопів. Цю величину можна вирахувати за формулою:

 

α

А = 0,61 ------------ ,

n · sin α

 

де А – роздільна здатність; 0,61 – коефіцієнт геометричних величин при вирахуванні освітленості першого дифракційного максимуму; λ – довжина світлової хвилі; n · sinα – постійна величина для кожного об’єктива, яка називається числовою або нумеричною апертурою.

У сучасних сухих об’єктивах вона не перебільшує 0,95, а в імерсійних – від 1,25 до 1,60. Нумеричні апертури вигравірувані на оправі кожного об’єктива. Роздільна здатність об’єктивів прямопропорційна їх нумеричній апертурі й обернено пропорційна довжині хвилі світла.

При мікроскопії у видимому світлі з довжиною хвилі 0,55 мкм та імерсійним об’єктивом з максимальною числовою апертурою 1,60 роздільна здатність дорівнює:

0,55

А = 0,61 ––––––– = 0,2 мкм .

1,60

 

Отже, при користуванні навіть найкращими імерсійними об’єктивами неможливо побачити об’єкти, які мають розміри менші за 0,2 мкм. Корисне збільшення об’єктива не може перевищувати нумеричну апертуру більше, ніж у 1000 разів. Таким чином, максимальне корисне збільшення сучасних мікроскопів при використанні імерсійних об’єктивів з апертурою 1,40-1,60 досягає 1400-1600.

Окуляр складається з двох лінз і тільки збільшує зображення, яке виходить від об’єктива, не добавляючи до нього будь-яких деталей. Існують окуляри з такими збільшеннями: х7, х10, х15. Ці цифри позначені на них.

Освітлювальний апарат знаходиться під предметним столиком і складається із дзеркала та конденсора з діафрагмою. Дзеркало спрямовує пучок світла в конденсор, а через нього – в об’єктив мікроскопа. Один бік дзеркала вігнутий, другий – плоский. При мікроскопуванні з конденсором необхідно користуватись лише плоским дзеркалом. Конденсор Аббе складається з системи лінз для збирання пучка променів в одній точці (фокус), яка знаходиться в площині досліджуваного препарату. При роботі з денним освітленням конденсор потрібно підіймати до рівня предметного столика, з штучним – опускати доти, поки зображення джерела світла не з’явиться в площині, препарату. При дослідженні незабарвлених препаратів конденсор також опускають.

Об’єм світла відповідно до потреб дослідження регулюється діафрагмою, яка знаходиться під конденсором. Вона може звужуватись і розширюватись подібно до зіниці ока (звідси назва іріс-діафрагма). Забарвлені препарати розглядають при відкритій, а незабарвлені – при звуженій діафрагмі.

Сучасні мікроскопи мають ряд удосконалень, завдяки яким покращується зображення та розширюються межі видимості. Перше досягнуто випуском мікроскопів-бінокулярів, друге – дослідженням у темному полі зору. Бінокулярний мікроскоп має спеціальну насадку з двома тубусами (бінокулярна насадка). Це створює ряд переваг при мікроскопуванні. Досліджуваний препарат розглядають відразу обома очима, що не викликає перевтоми органа зору. При цьому одночасно досягається більша чіткість глибини зображення і його пластичність.

З метою фундаментальних досліджень морфології мікроорганізмів та інших клітин оптична промисловість випускає більш досконалі мікроскопи. Одним із них є мікроскоп універсальний біологічний дослідницький МБД-15 . За його допомогою можна проводити широкий об’єм мікроскопічних досліджень: візуальне спостереження, використання світлого і темного полів зору в прямому, косому та відбитому світлі, методу фазових контрастів, люмінесцентної та інтерференційної мікроскопії. Для мікрофотографування досліджуваних об’єктів мікроскоп оснащений фотоапаратом з автоматичним затвором, фотоекспонометром та імпульсною лампою.

При вивченні динаміки розвитку і розмноження мікроорганізмів, дії на них різних фізичних і хімічних факторів, утворення L-форм та інших проблем виготовляють спеціальні мікроскопи з мікроустановками для цейтраферної (переривчастої) мікрокінозйомки особливо з використанням методу фазових контрастів.

Правила роботи з імерсійною системою:

1. Підняти конденсор Аббе до рівня предметного столика, повністю відкрити іріс-діафрагму.

2. Користуючись об’єктивом 8, за допомогою плоского дзеркала домогтися максимального освітлення поля зору.

3. На предметному столику розмістити забарвлений препарат-мазок, нанести на нього кедрову олію і закріпити клемами.

4. Повертаючи револьвер, встановити над препаратом імерсійний об’єктив 90, під контролем зору занурити його в краплю кедрової олії.

5. Дивлячись в окуляр лівим оком (не закриваючи правого), спочатку за допомогою макрогвинта знайти контури зображення, потім, користуючись мікрогвинтом, досягти максимальної чіткості, вивчити і замалювати препарат.

6. Після закінчення роботи підняти тубус, зняти предметне скло, обережно витерти імерсійний об’єктив від кедрової олії, повернути його вбік, опустити тубус.

Освітлення за методом Келлера. Найкращі результати мікроскопії при суб’єктивних дослідженнях і мікрофотографуванні можна отримати лише при умові чіткого центрування всіх оптичних частин мікроскопа, включаючи і систему освітлення. Цього досягають при використанні методу Келлера.

1. Фабричний освітлювач з "точковим" джерелом світла встановлюють на віддалі 25-30 см від мікроскопа так, щоб плоске дзеркало відкидало світлову пляму діаметром біля 8 мм на закриту діафрагму конденсора. За цим процесом слідкують за допомогою дзеркальця, покладеного на праву ніжку мікроскопа.

2. На предметний столик вміщують препарат, користуючись сухими об’єктивами (8х, 40х), наводять чітке зображення, знімають окуляр і на верхній кінець тубусу кладуть матове скельце. На ньому видно зображення об’єкту в центрі світлового п’ятна. При необхідності установку корегують. Відкривають до оптимального діаметру отвір діафрагми конденсора.

3. Встановлюють необхідний об’єктив і окуляр (краще 10х) і приступають до вивчення або фотографування досліджуваного об’єкту.

Препарати-мазки слід виготовляти на предметних скельцях товщиною не більше 1,1-1,4 мм.

Темнопольна мікроскопія відрізняється від звичайної імерсійної світлової способом освітлення препарату. У звичайному мікроскопі об’єкт досліджують при світлі, яке проходить, у темнопольному – при боковому освітленні. Для мікроскопії в темному полі використовують замість конденсора Аббе спеціальний параболоїд-конденсор (кардіоїд-конденсор), у якому бокова поверхня дзеркальна а центральна частина нижньої лінзи затемнена, в результаті чого утворюється темне поле зору. Яскраві бокові промені, відбиваючись від дзеркальної поверхні, фокусуються в площині об’єкта, але в очі мікроскопіста не потрапляють. В об’єктив проникають лише ті промені, які відбиваються частинками препарату завдяки заломленню або дифракції. Отже, на темному полі зору мікробні клітини й інші дрібні частинки виглядають дуже яскравими. Картина нагадує миготливі зірки на темному небі.

Темнопольний мікроскоп дає змогу розглядати об’єкти розміром 0,02-0,04 мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Тому темнопольний мікроскоп часто називають ультрамікроскопом. Мікроскопію в темному полі зору використовують для дослідження рухливості бактерій, виявлення збудників сифілісу, лептоспірозу, поворотного тифу. Але при цьому не можна добре вивчити внутрішню структуру мікроорганізмів. Для цієї мети запропоновані видозмінені методи оптичної мікроскопії: фазово-контрастна, аноптральна та люмінесцентна.

Фазовоконтрастна мікроскопія – спосіб мікроскопічного дослідження прозорих, не поглинаючих світла об’єктів, який базується на підсиленні контрасту зображення. Він полягає в тому, що живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи світло, все ж таки здатні змінювати фазу проникаючих променів. У різних ділянках клітини товщина, щільність, а, отже, й показники заломлення світла будуть неоднакові. Ці різниці у фазах ні орган зору, ні фотоплівка не помічають. Але їх можна зробити видимими за допомогою спеціального фазовоконтрастного пристрою. Він включає в себе конденсор з набором кільцевих діафрагм, які забезпечують освітлення препарату повним конусом світла, та фазовоконтрастні об’єктиви. Вони відрізняються від звичайних об’єктивів тим, що в їх головному фокусі розташовується напівпрозора фазова пластинка у вигляді кільця. Саме вона викликає здвиг фази світла, що проходить через неї. Це дозволяє зробити незабарвлені препарати чітко видимими.

При роботі з фазовоконтрастним пристрієм клітини можуть виглядати темними (позитивний фазовий контраст) або світлими (негативний контраст) у порівнянні з оточуючим фоном. Рис.3 Цей вид мікроскопії не збільшує роздільної здатності, але дозволяє виявити нові деталі внутрішньої структури живих бактерій, стадії їх розвитку, зміни під впливом антибіотиків та інших хіміопрепаратів. Він має й деякі недоліки: слабка контрастність зображень, наявність сяючих ореолів навколо досліджуваних об’єктів. Значні переваги перед фазовоконтрастним пристрієм має аноптральний мікроскоп.

Аноптральна мікроскопія – різновид фазовоконтрастної, при якій використовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько 10 % світла, яке проходить через об’єктив і робить фон поля зору сіро-коричневим. Широкий центральний отвір в шарові кіптяви чи міді випускає з об’єктиву основну частину дифрагованого світла, в той час як темний шар кільця відіграє роль ловушки для небажаного периферійного дифрагованого світла. За рахунок цього в значній мірі усувається ореол навколо досліджуваних клітин.

Аноптральна мікроскопія успішно використовується при вивченні таких малоконтрастних живих об’єктів як бактерії, гриби, найпростіші і навіть деякі віруси. При цьому досягається більша контрастність, роздільна здатність, стереоскопічність і чіткість зображення. Досліджувані мікроорганізми при цьому набувають різних відтінків: від білого до золотаво-коричневого.

Інтерференційна мікроскопія основана приблизно на тих же принципах, що й фазовоконтрастна. Але на відміну від останньої вона дає можливість вивчати деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається завдяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку об’єкту, а другий поза нею. В окулярі обидва промені з’єднуються і інтерферують між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим самим масу різних структур в клітині. Так визначають товщину об’єкта, концентрацію в ньому сухої речовини, вміст води, що дає змогу зробити побічні висновки про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин.

Інтерференційну мікроскопію використовують у цитологічних дослідженнях, при кількісному аналізі клітинних структур живих об’єктів, наприклад, найпростіших, культур тканин тощо.

Люмінесцентна мікроскопія останнім часом широко використовується в мікробіологічних дослідженнях. Цей метод дозволяє спостерігати первинну або вторинну люмінесценцію (світіння) мікроорганізмів, клітин, тканин та окремих їх структур. Зображення в люмінесцентному мікроскопі виникає із-за світіння самого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовою частиною спектра. Метод оснований на використанні явища флуоресценції. Так як більшість хвороботворних мікробів не мають первинної (власної) люмінесценції, їх спочатку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників (флуорохромів), які зв’язуються певними структурами живих бактерій, не завдаючи їм шкоди. Найчастіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, корифосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну, трипафлавін та ін.

Промені світла від сильного джерела, наприклад, ртутної лампи надмірного тиску, пропускають через синьо-фіолетовий світлофільтр. Під дією такого опромінення забарвлені флуорохромом бактерії починають світитися червоним, зеленим, жовтим або іншим світлом. Так, при забарвленні дифтерійних паличок корифосфіном вони набувають жовто-зеленого світіння, а при обробці аурамін-родаміном збудник туберкульозу світиться золотаво-оранжевим кольором.

Метод люмінесцентної мікроскопії набагато чутливіший порівняно з іншими мікроскопічними дослідженнями. Він дозволяє виявити таку малу кількість збудника, яку іншими методами не знаходять. За характером люмінесценції можна диференціювати окремі хімічні речовини, що входять до складу мікробних клітин. Використання люмінесцентного мікроскопа має ряд переваг: кольорове зображення, висока контрастність, можливість досліджувати як живі, так і вбиті мікроорганізми.

Люмінесцентну мікроскопію широко застосовують для виявлення антигенів і антитіл (метод імунофлуоресценції). За її допомогою можна побачити мікроби, які містять певні антигени. Для їх виявлення необхідно мати специфічні люмінесцентні сироватки, які викликають флуоресценцію саме даного антигена. Цей метод успішно використовують для експрес-діагностики багатьох бактерійних і вірусних захворювань.

Окрім люмінесцентного пристрою ОІ-17 та спеціальних освітлювачів ОІ-18, ОІ-28, ОСЛ-1, бактеріологічні лабораторії оснащені люмінесцентними мікроскопами МЛ-2, МЛД-1 та ін. Модель МЛ-2 має великий комплект оптики, фільтрів, фотонасадку, дає змогу проводити одночасно комбіновані спостереження: люмінесцентне при освітленні препарату зверху і фазовоконтрастне в проходящому світлі.

Електронна мікроскопія. Для вивчення будови мікроорганізмів на субклітинному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку електронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис до 5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі (растрові) й комбіновані електронні мікроскопи.

Принципова схема просвічуючого електронного мікроскопа мало чим відрізняється від звичайного оптичного. Можливості світлового мікроскопа обмежені не якістю лінз, а великою довжиною світлових хвиль (0,29-0,8 мкм). Мала довжина хвилі електронів (0,0002 мкм і навіть менше) дозволяє значно збільшити роздільну здатність електронного мікроскопа. Замість світла в ньому використовують потік електронів, джерелом яких є вольфрамова нитка, що нагрівається електричним струмом (електронна пушка). Роль лінз оптичного мікроскопа виконує кругове електромагнітне поле. Пучки електронів, проходять через досліджуваний об’єкт, відхиляються під різними кутами залежно від неоднакової товщини і щільності різних ділянок препарату і потрапляють в об’єктивну лінзу. В ній появляється перше корисне збільшення об’єкта.

Після об’єктивної лінзи електрони потрапляють у проміжну лінзу, яка служить для плавного збільшення зображення. Проекційна лінза створює кінцеве збільшене зображення об’єкта, яке направляється на флюресціюючий екран. Завдяки взаємодії швидких електронів з люмінофором екрану виникає видиме зображення об’єктів. Після наведення чіткості проводять фотографування.

Електронна мікроскопія вимагає спеціальної підготовки об’єктів дослідження. Необхідна спеціальна фіксація тканин або бактерій, їх ретельне зневоднення, заливка в епоксидні смоли, виготовлення ультратонких зрізів. Для підвищення чіткості зображення використовують методи позитивного й негативного контрастування та відтінення.

Досліджуваний об’єкт спочатку застосовують особливими фіксаторами, потім наносять на надзвичайно тонку колодієву або целюлозну плівку, вміщену на спеціальну сіточку-підкладку. При напиленні на поверхню препарату під певним кутом у вакуумі наносять тонким шаром важкі метали, хром, золото, паладій. Розпорошені частинки металу осідають на піднесених чи заглиблених ділянках бактерій або вірусів. При дослідженні таких препаратів деталі їх структури проявляються рельєфно й контрастно (позитивне контрастування). Негативне контрастування зводиться до нанесення на препарат розчинів з атомами важких металів, наприклад, фосфорно-вольфрамової кислоти. Осідаючи навколо білкових частинок досліджуваного об’єкта й заповнюючи всі проміжки між ними, атоми важких металів "забарвлюють" фон, на якому виступають найменші деталі будови мікроорганізмів.

Широко також використовують ультратонкі зрізи клітин, бактерій і вірусів, що дає змогу вивчити їх структуру на субклітинному й молекулярному рівнях.

Сучасна українська й зарубіжна промисловість випускає багато моделей електронних мікроскопів (рис.5), які мають величезні можливості для вивчення мікроскопічного світу.

Методи електронної мікроскопії привели до великих успіхів у розвитку таких наук як цитологія, бактеріологія, генетика і, особливо, вірусологія. Успішно розвивається імунна електронна мікроскопія, яка дає змогу визначити родову належність вірусів, що використовується для експрес-діагностики багатьох вірусних інфекцій.

Бактеріологічний, серологічний, біологічний та алергічний методи діагностики інфекційних хвороб детально викладені в наступних розділах.


 

Лабораторна робота № 2

Загрузка...



<== попередня сторінка | наступна сторінка ==>
Методи лабораторних досліджень | Виготовлення мазків і методи їх забарвлення. Прості методи забарвлення.

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:


 

© studopedia.com.ua При використанні або копіюванні матеріалів пряме посилання на сайт обов'язкове.


Генерація сторінки за: 0.003 сек.