Новини освіти і науки:

G+

Тлумачний словник
Авто
Автоматизація
Архітектура
Астрономія
Аудит
Біологія
Будівництво
Бухгалтерія
Винахідництво
Виробництво
Військова справа
Генетика
Географія
Геологія
Господарство
Держава
Дім
Екологія
Економетрика
Економіка
Електроніка
Журналістика та ЗМІ
Зв'язок
Іноземні мови
Інформатика
Історія
Комп'ютери
Креслення
Кулінарія
Культура
Лексикологія
Література
Логіка
Маркетинг
Математика
Машинобудування
Медицина
Менеджмент
Метали і Зварювання
Механіка
Мистецтво
Музика
Населення
Освіта
Охорона безпеки життя
Охорона Праці
Педагогіка
Політика
Право
Програмування
Промисловість
Психологія
Радіо
Регилия
Соціологія
Спорт
Стандартизація
Технології
Торгівля
Туризм
Фізика
Фізіологія
Філософія
Фінанси
Хімія
Юриспунденкция

Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера.

Оцтово-кислий метиленовий синій за Нейссером

Метиленовий синій 0,1 г

Етанол 96° 2 мл

Льодяна оцтова кислота 5 мл

Дистильована вода 100 мл

Везувін

Везувін 12 г

Етанол 96° 60 мл

Дистильована вода 40 мл

Хризоїдин

Хризоїдин 1 г

Дистильована вода 150 мл

Барвник розчиняють у киплячій воді.

Метод П’ю. Готують спеціальний барвник: до 2 мл етанолу добавляють 0,2 г толуїдинового синього, потім 100 мл 5 % розчину оцтової кислоти. Барвник стійкий, зберігається довго. На фіксований мазок наливають приготовлений барвник і підігрівають до появи парів на протязі 1-2 хв, охолоджують, промивають водою, висушують і мікроскопують. Волютинові зерна мають темно-синє забарвлення. Метахромазія особливо чітко виступає при штучному освітленні.

Метод Мейера. Окрім метахромазії, забарвлений волютин має ще й значну кислотостійкість. Саме ця властивість і лежить в основі методу. З досліджуваного матеріалу роблять два тонких мазки (подібно до мазків крові), фіксують їх на полум’ї (або в рідині Карнуа) і забарвлюють метиленовим синім протягом 10 хв. Один мазок занурюють на 5 хв у 1 % водний розчин сірчаної кислоти, другий – на такий же час у 4 % розчин калію карбонату. Обидва мазки, не промиваючи водою, висушують фільтрувальним папером. Перший препарат помічають літерою К (кислота), другий – Л (луг). Мазок К додатково забарвлюють хризоїдином (або 0,25 % розчином світлого зеленого). Цитоплазма бактерій у мазку К забарвлюється в світло-коричневий (або зелений) колір, волютинові зерна – у вишнево-червоний. У мазку Л цитоплазма виглядає слабко забарвленою, а на місці метахроматичних зерен видні пустоти (знебарвлений волютин).

Метод Мейера дає найвірогіднішу можливість встановити волютинову природу включень.

Метод Раскіної. Барвник готують за таким прописом: фенолового фуксину Циля – 4 мл, льодяної оцтової кислоти – 5 мл, етанолу 96° – 95 мл, дистильованої води – до 200 мл. Його наливають на фіксований жаром препарат, підігрівають на полум’ї газового пальника до повного випарування барвника, промивають водою, висушують і мікроскопують. Цитоплазма бактерій забарвлюється в світло-червоний колір, а зерна волютину – в чорно-синій.

Оболонка бактерій складається з цитоплазматичної мембрани, клітинної стінки й капсули.

Цитоплазматична мембрана – м’яка, пластична, трьохшарова поліфункціональна структура. Вона здатна утворювати інвагінати, які називаються мезосомами, і відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини.

Клітинна стінка – своєрідний захисний шар, який визначає і зберігає постійну форму бактерій, захищає цитоплазму від дії механічних і осмотичних сил і виконує ряд інших важливих функцій. Вона є унікальним структурним компонентом, властивим тільки бактеріям (окрім мікоплазм). Морфологічно вона складається з двох шарів: зовнішнього – пластичного і внутрішнього – ригідного, пружного.

Із-зовні мікробні клітини можуть бути вкриті речовиною слизового характеру, яку називають капсулою. У бактерій розрізняють мікрокапсулу, капсулу й слизовий шар. Мікрокапсула складається з мукополісахаридних фібрил, які невидимі під світловим мікроскопом, а виявляються лише при електронній мікроскопії.

Капсула являє собою міцно зв’язаний з клітинною стінкою особливий слизовий шар. Одні бактерії утворюють капсули тільки в організмі людей і тварин (збудники сибірки, чуми, крупозної пневмонії), у інших вона завжди є в усіх середовищах (клебсієли). Інколи капсула оточує разом декілька клітин (сибіркова бацила, лейконосток), тоді такі структури називають зооглеями. Окремі види мікробів виділяють слизові екзополімери у великій кількості, вони неміцно зв’язані з клітинною стінкою, утворюючи рихлий слизовий шар.

При повсякденних діагностичних лабораторних дослідженнях потреба виявляти клітинну стінку чи цитоплазматичну мембрану майже не виникає. Під світловим мікроскопом ці структури можна виявити за допомогою явищ плазмолізу або плазмоптизу. Якщо бактерії помістити в гіпертонічний розчин, виникає їх сильне зневоднення, цитоплазма клітин зморщується й відстає від клітинної стінки (плазмоліз). Під мікроскопом видимі контури бактерій, тобто їх клітинні стінки. Якщо ж помістити мікроби в дистильовану воду (або гіпотонічний розчин), спостерігається протилежне явище –плазмоптиз. Вода направляється в клітину, яка згодом набрякає й лопається. При мікроскопії таких клітин спостерігають лише їх контури (чохли).

Розроблені також методи спеціального забарвлення клітинної стінки. Найбільш відомими з них є методи Пешкова, Гутштейна, Кнайзі.

Метод Пешкова. Мазок спочатку обробляють спеціальним фіксатором (60 мл 90 % етанолу, 30 мл хлороформу і 10 мл оцтової кислоти) на протязі 15 хв, потім протравлюють у 10 % розчині таніну 5 хв, промивають водою і забарвлюють водним розчином основного фуксину протягом 30-60 сек. Препарат висушують на повітрі й мікроскопують. Оболонка виглядає як тонкий червоний обідок навколо бактерійної клітини.

Надійний спосіб забарвлення клітинної стінки, як варіант методу Гутштейна, описав Сінай. Препарат фіксують рідиною Карнуа, протравлюють 2-5 хв 10 % розчином таніну, промивають водою і розглядають в надавленій краплі 0,02 % водного розчину кристалічного фіолетового. Забарвлення оболонки в фіолетовий колір наступає вже через 5-10 сек.

Метод Кнайзі. Зафіксований в полум’ї пальника мазок протравлюють у спеціальному розчині (насичений водний розчин калійних галунів – 70 мл, 20 % розчин таніну – 30 мл), промивають водою, наносять краплю фенолового фуксину, накривають покрівним скельцем і розглядають під мікроскопом. Клітинна стінка фарбується в червоний колір.

Забарвлення капсул. Капсули бактерій містять складні гетерополісахариди і поліпептиди, мають гелеподібну консистенцію. При звичайних методах фарбування вони погано сприймають барвники. Лише у препаратах-відбитках з уражених тканин і органів, мазках із гною, харкотиння вони виявляються при будь-якому методі фарбування у вигляді незабарвлених зон (ореолів) між забарвленими тілами бактерій і субстратом. Для фарбування самих капсул запропоновані різні методи.

Метод Гінса. З досліджуваного матеріалу роблять негативний препарат за способом Буррі. Мазок фіксують сумішшю Никифорова, або метанолом, промивають водою і забарвлюють 3-5 хв за Гінсом феноловим фуксином Циля, розведеним 1:3. Промивають водою, висушують, мікроскопують під імерсійним об’єктивом. На темному димчасто-сірому фоні контракстно виділяються незабарвлені капсули, всередині яких знаходяться яскраво-червоні тіла бактерій.

Метод Гісса. Тонкий мазок фіксують у спирт-формолі, або суміші Никифорова (але не жаром), фарбують розчином основного фуксину (1 ч насиченого спиртового розчину барвника + 19 ч дистильованої води) з підігріванням до появи парів, потім залишають на 30 сек для охолодження. Препарат промивають великою кількістю розчину мідного купоросу, висушують, не промиваючи водою, і мікроскопують. Капсули забарвлюються в голубий колір, тіла мікробів – у темно-червоний.

Метод Романовського-Гімзи. На мазок, фіксований метанолом, або сумішшю Никифорова, наносять розведений барвник Гімзи (2 краплі на 1 мл дистильованої води), фарбують 20-30 хв, швидко змивають водою, висушують і мікроскопують. Бактерії забарвлюються в синій колір, капсули – у блідо-рожевий. Метод постійно дає хороші результати. Інші способи забарвлення капсул (Антоні, Кніге, Ольта, Кауфмана) дають менш демонстративні результати.

Забарвлення спор. Деякі бактерії при несприятливих умовах здатні утворювати ендоспори. При дослідженні незабарвлених мазків із старих агарових культур спори виявляються у вигляді круглих, або овальних утворень, які сильно заломлюють світло, і виглядають пустотами. Вони погано забарвлюються аніліновими барвниками при звичайних методах фарбування.

Розміри спор можуть не перебільшувати діаметр мікробної клітини (Bacillus), або бути більшими за нього (Clostridium). Спори в клітині можуть розміщуватись центрально (збудник сибірки), субтермінально (палички ботулізму, газової гангрени), або термінально (палички правця).

Для виявлення спор розроблені спеціальні методи їх забарвлення. Всі вони основані на дії протрав, які розрихлюють міцні оболонки спор і полегшують проникнення барвників.

Метод Ожешки. На приготовлений густий незафіксований мазок спороносної культури бактерій наливають 0,5 % розчин соляної кислоти й підігрівають 3-4 рази до появи парів (протрава). Препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером і фіксують у полум’ї пальника. Потім мазок забарвлюють за методом Циля-Нільсена, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в голубий колір, спори – в червоний.

Метод Пешкова – простий і надійний спосіб забарвлення спор, який не вимагає хімічних протрав і диференціювання в кислоті чи спирті. Його проводять за таким алгоритмом.

1. Виготовляють мазок, висушують і фіксують у полум’ї газового рожка, або в спиртовому формаліні.

2. На препарат наливають лужний метиленовий синій і доводять його до кипіння, періодично вносячи в полум’я на 15-30 сек.

3. Барвник змивають водою і додатково фарбують 0,5 % водним розчином нейтрального червоного впродовж 30-40 сек. Промивають дистильованою водою, висушують, розглядають за допомогою масляної імерсії. Спори виглядають синіми, або голубими, цитоплазма – рожевою.

Метод Мюллера. На зафіксований в полум’ї мазок наливають 5 % водний розчин хромової кислоти на 2-3 хв, промивають водою, висушують і забарвлюють за методом Циля-Нільсена, мікроскопують. Спори набувають червоного кольору, а цитоплазма бактерій – синього.

Метод Шеффера-Фултона. Густий мазок фіксують у полум’ї, наливають 5 % водний розчин малахітового зеленого, 3-4 рази нагрівають до появи парів, промивають струменем проточної води 30-40 сек і додатково забарвлюють 0,5 % водним розчином сафраніну, промивають водою і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в червоний, а спори – в зелений колір.

Забарвлення джгутиків. У деяких видів плаваючих бактерій є спеціальні органи руху – джгутики, розміри яких досягають 0,02-0,04 мкм у ширину і 6-80 мкм у довжину. Вони містять особливий скоротливий білок флагелін. За кількістю і розташуванням джгутиків рухливі бактерії поділяють на 4 групи:

1. Монотрихи – один полярно розташований джгутик (холерний вібріон);

2. Лофотрихи – пучок джгутиків на одному кінці (псевдомонади);

3. Амфітрихи – поодинокі або пучки джгутиків на обох кінцях бактерій (спірили);

4. Перитрихи – багато джгутиків, розташованих навколо клітини (збудник червоного тифу, кишкова паличка).

Число, спосіб розміщення і розміри джгутиків є постійними ознаками для певного виду бактерій, що враховують при проведенні їх систематики.

Виявити джгутики можна за допомогою прямих та непрямих методів. При прямих методах джгутики забарвлюють барвниками або солями металів. Обов’язково вживають протрави, які сприяють осіданню на джгутиках препаратів срібла або заліза, що приводить до штучного збільшення їх діаметра. Вони стають видимими під світловим мікроскопом. До прямих методів виявлення джгутиків відносяться і дослідження їх під електронним мікроскопом на ультратонких зрізах.

При непрямих методах спостерігають за рухом бактерій у висячій або надавленій краплі за допомогою світлової, темнопольної, фазовоконтрастної та аноптральної мікроскопії.

Забарвлення джгутиків – одна з самих тонких, складних і вимогливих бактеріоскопічних методик. Запропоновано багато складних методів їх фарбування: Леффлера, Грея, Морозова, Уварова, Бенін’єтті та ін. Самим надійним із них є метод Леффлера.

Метод Леффлера. Важливою умовою для успішного забарвлення є виготовлення мазків із молодої (12-18 год) агарової культури на ідеально чистих і знежирених скельцях. Бактеріологічною петлею беруть невелику кількість культури і вносять її в 5-6 мл водопровідної води, не емульгуючи, а залишаючи петлю до тих пір, поки бактерії самі розійдуться в рідині. Пастерівською піпеткою з тонко відтягнутим капіляром наносять на скельце 5-6 окремих крапель суспензії бактерій у воді, висушують на повітрі. Фіксують дуже обережно, один раз швидко провівши препарат через полум’я.

Для забарвлення необхідно приготувати такі розчини:

1. Протрава: 1 мл насиченого спиртового розчину основного фуксину, 10 мл 20 % водного розчину таніну, 5,5 мл насиченого на холоді водного розчину сірчанокислого закисного аміачного заліза. Розчин готують за 1-2 доби до вживання, перед використанням обов’язково фільтрують.

2. Концентрований феноловий фуксин Циля, наполовину розведений водою і профільтрований.

На фіксований препарат наносять надлишок протрави й залишають її протягом 10-15 хв, промивають дистильованою водою до повного видалення протрави. Фарбують профільтрованим фуксином Циля протягом 3-5 хв, промивають водою, висушують і мікроскопують. Тіла бактерій забарвлюються в темний червоно-коричневий колір, джгутики виглядають світлішими, такого ж відтінку.

Метод Бенін’єтті. Суспензію бактерій і мазок роблять так само, як і за методом Леффлера. Протраву і забарвлення проводять одним фарбуючим розчином, який завжди готують ex tempore: розчин 1 – сірчанокислого цинку 1 г, таніну 10 г, дистильованої води 100 мл; розчин 2 –насичений спиртовий розчин генціана фіолетового.

Змішують 5 мл першого і 3 мл другого розчинів. Суміш наносять на препарат-мазок, тричі нагрівають до появи парів, охолоджують, добре промивають водою. Висушують і мікроскопують. Тіла бактерій фарбуються в темно-фіолетовий колір, джгутики мають більш ніжне забарвлення.

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Забарвлення окремих структур мікробної клітини	\|	Мікроскопічне дослідження живих мікробів.

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.007 сек.