Трансплантація ядер і реконструювання клітин.

Після енуклеації клітин моношар цитопластів у пластикових чашках діаметром 60 мм чи скляних дисках діаметром 14 мм інкубують у поживному середовищі при 37 °С протягом 1-2 годин, а потім — 20 хв і охолоджують до 4 °С. При цій температурі моношар двічі відмивають розчином Ерла (рН 8,0), потім 20 хв. обробляють 0,5 мл охолодженого розчину Ерла з вірусом Сендай, інактивованим опроміненням протягом 5 хв (ультрафіолетовою лампою на відстані 15 см), після чого шар цитопластів знову двічі промивають тим же розчином, який потім видаляють.

Каріопласти, суспендовані в сольовому розчині на фосфатному буфері, додають до моношарової культури цитопластів з таким розрахунком, щоб на один цитопласт припадало 100 каріопластів. Для адсорбування каріопластів на цитопластах, по- критих вірусними частками, інкубують при 4 °С протягом 45 хв; через кожні 3-5 хв чашки злегка погойдують. Для злиття каріопластів і цитопластів чашки чи скляні диски переносять у термостат і витримують там при 37 °С протягом 45 хв. Після закінчення цього часу моношар на чашках кілька разів інтенсивно відмивають розчином Ерла чи поживним середовищем без сироватки, щоб видалити каріопласти, які не злилися. Потім у чашки наливають поживне середовище, придатне для культивування того типу клітин, що були використані як донори каріопластів. Цитопласти, що не злилися з ядрами, гинуть і приблизно через 2 дні відокремлються від поверхні чашки.

Для одержання незабруднених цитопластами культур рекомендується центрифугування гібридних клітин у градієнті щільності ренографіну.

Використання поліетиленгліколю для стимулювання процесу злиття каріопластів і цитопластів при конструюванні клітинних гібридів обмежене через його токсичність, що значно перевищує токсичність вірусу Сендай.

Для ідентифікації гібридних Іслітин, визначення ефективності трансплантації ядер і наявності батьківських клітин у гібридній популяції використовують мутантні клітинні лінії.

Ефективність реконструювання клітин за рахунок злиття каріопластів і цитопластів залежить від багатьох факторів) Коли гібридизації піддавали цитопласти, отримані з фібробластів курячих ембріонів, і каріопласти, що являли собою перебуваючі у спокої ядра еритроцитів, ефективність реконструювання перевищувала 90 %.

У гібридних клітинах відразу після злиття починаються морфологічні зміни. Через кілька днів реконструйовані гібридні клітини майже не відрізняються від вихідних батьківських, які було використано як донори ядер.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Біотехнологія трансплантації ядер	\|	Контрольні запитання і завдання

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.