Приклад Нозерн блот

Кроки в Нозерн блот

Нозерн блот

Генна експресія проаналізована Нозерн блот

Зразки РНК піддаються електрофорезу

РНК розділяють молекулярною масою

Передання в мембрану

Зонт мічені

- Радіоактивність або антитіла ліганда

Гібридизовані з РНК на мембранні

Гібридизація залежить від часу, температури, концентрації солі і послідовності нуклеїнових кислот і концентрації.

До винаходу мікрочіпів, експресія гена була проаналізована в першу чергу через техніку, відому як Нозерн блот. Назва походить від того, що гібридизація пов'язаними з мембраною ДНК була вперше використана E. M . Саузерном і називається Саузерн-блот. Гібридизація пов'язаними з мембраною РНК, називається Нозерн. У цій процедурі, зразки РНК обробляються для денатурації їх вторинної структури, а потім завантажуються в агарозний гель і розділяються за допомогою електрофорезу, який дозволяє меншим молекулам РНК переміщуватися швидше через гель, ніж більш великим молекулам. Потім, через процес, який використовує капілярну дію, РНК переноситься з гелю на мембрану, виготовлену з нейлону або нітроцелюлози. Зонд, який зазвичай складається з фрагментів ДНК позначається або з радіоактивними ізотопами або лігандами для антитіл. Гібридизація відбувається в контейнері з мінімальним реакційним об’ємом . Варіюючи час гібридизації з температурою і концентрацією солі можна сприяти суворо комплементарним взаємодіям або вирішити деякі невідповідності основ. Враховуючи невідповідність було б бажано, якщо зонд перебуває від одного виду і РНК на мембрану від різних видів. Після того як гібридизація завершена, незв'язаний зонд повинен бути змитий. Умови (час, температура і концентрація солей) також грають роль у визначенні того, які строго комплементарні взаємодії є кращими. Температури і концентрації солей, визначають "жорсткість" гібридизації, висока температура і низький вміст солі вказує на висоту жорсткості.

На цій схемі Нозерн блот , РНК, яке було ізольовано з тканини, розділено гелем-електрофорезом в залежності від молекулярної ваги. РНК потім переноситься з гелю на нейлонову мембрану під дією капілярних сил. РНК на мембрані гібридизоване з міченим зондом. Надлишок зонда потім змивається, і мембрана знаходиться на рентгенівській плівці. Після фільму(film is developed) , з'являється смуга, яка вказує розташування РНК, яке є доповненням до зонду.

Приклад часу генної індукції

Верхня панель: РНК після електрофорезу

Смуги відповідають рибосомальній РНК

Зонт виявляє дві смуги

Нижня панель: Нижня смуга вказує на швидкість індукції, а потім знижується.

Верхня смуга показує повільну індукцію, але індукція проходить довше.

У цьому прикладі Нозерн блот експерименту , верхня панель являє собою фотографію гелю після електрофорезу. РНК була витягнута в різні моменти часу після впливу на клітини eliciter (молекула, яка викликає реакцію). Дві смуги з'являються в бромистого етидію - забарвлених гель, який відповідає рибосомальній РНК. Інша частина РНК складається з молекул різних розмірів і, отже, виступає як мазок. РНК переносили на мембрану і гібридизовали з радіоактивно міченим зондом. Нижня панель показує авторадіограму, що вказує на гібридизації двох РНК з різними розмірами і індукцією. Нижня смуга швидко індукована (через 2 години), а потім залишається високою до 12 годин, після чого починає знижуватися інтенсивність. Верхня смуга займає більше часу, щоб досягти максимального рівня, але, здається, не знижуватися навіть після 24 годин.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Гібридизація	\|	Субклонування

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.004 сек.