Виготовлення мазків і методи їх забарвлення. Прості методи забарвлення.

Бактеріоскопічне дослідження будь-кого клінічного матеріалу, де знаходяться збудники інфекційних хвороб, є однією з найпоширеніших мікробіологічних методик. У лабораторній практиці частіше проводять мікроскопію фіксованих забарвлених мазків і рідше нативних препаратів у вигляді надавленої і висячої крапель. Їх виготовляють на заздалегідь підготовленому і оснащеному робочому місці.

На столі повинні бути лише необхідні матеріали, інструменти і пристрої: клінічний матеріал (кров, гній, слиз, харкотиння, сеча, випорожнення та ін.), культури мікроорганізмів у пробірках або чашках Петрі, бактеріологічні петлі, піпетки, пінцети, штативи, предметні скельця, газовий пальник, ізотонічний розчин хлориду натрію, розчини барвників, лотки з рейками для фарбування мазків, промивалка з водою, фільтрувальний папір, банка з дезрозчином для знезараження використаних препаратів і піпеток. Доцільно в лабораторії обладнати окремий столик для забарвлення мазків.

Препарати-мазки виготовляють на предметних скельцях, товщина яких із-за оптичних властивостей конденсора Аббе не повинна перебільшувати 1-1,2 мм. Скельця необхідно заздалегідь ретельно знежирити. Для цього на протязі доби їх витримують у концентрованій сірчаній кислоті або кип’ятять у суміші 6 % розчину двохромового калію і сірчаної кислоти, ретельно промивають проточною водою, переносять у банку з 96° спиртом, де вони зберігають до вживання. Можна знежирені і витримані в спирті скельця витерти насухо льняною тканиною і зберігати в герметично закритій скляній банці. Крапля води, нанесена на холодне знежирене скло, повинна рівномірно розтікатися, а не збиратись у дрібні крапельки.

Виготовлення препаратів-мазків із щільного (густого) клінічного матеріалу або з культури на твердому середовищі. Знежирене предметне скельце проводять через полум’я газового пальника і після охолодження кладуть на робоче місце. Для виготовлення мазка матеріал чи культуру беруть бактеріологічною петлею з платинового або хромо-нікелевого дроту довжиною 5-6 см. Петлю закріплюють у петлетримачі. Кінець її згинають у вигляді замкнутого кільця розміром 1х1,5 м або 2х3 мм. Для деяких робіт потрібно мати цей інструмент у вигляді голки, коли кінець не згинають у кільце, а залишають прямим.

Бактеріологічну петлю прожарюють у полум’ї, тримаючи її як олівець вертикально у правій руці. Два-три рази проводять через полум’я і третю частину петлетримача. Не випускаючи петлі, лівою рукою беруть пробірку з 0,9 % стерильним розчином хлориду натрію а 4-им і 5-им пальцями правої руки зажимають ватно-марлеву пробку, витягують її, і вінця пробірки проносять через полум’я пальника. Тримають на віддалі 15-20 см від полум’я, не випускаючи пробки. Петлю вводять у пробірку і охолоджують її, торкаючись стінки. Занурючи петлю в рідину, набирають краплю фізрозчину. Виймають петлю, проводять пробку і відкритий край пробірки через полум’я, після чого її закривають і ставлять у штатив. На центр скельця бактеріологічною петлею наносять взяту краплю ізотонічного розчину.

Петлю знову стерилізують, у ліву руку беруть пробірку з досліджуваним матеріалом чи культурою мікроорганізмів. Відкривають пробірку із дотриманням усіх правил, охолоджують петлю і набирають нею невелику кількість матеріалу чи культури. Петлю виймають, а пробірку закривають і ставлять у штатив. Взятий матеріал (або культуру) наносять на скло біля краплі фізрозчину і, поступово розтираючи його та емульгуючи в краплі, готують тонкий, рівномірний мазок округлої чи овальної форми діаметром 1-1,5 см. Після цього петлю прожарюють і ставлять у штатив.

Виготовлення мазків із рідкого клінічного матеріалу або з культури на рідкому середовищі. Бактеріологічною петлею набирають краплю досліджуваного матеріалу або культури з рідкого середовища із дотриманням правил стерильності, як описано вище. Взятий матеріал наносять на предметне скельце і роблять рівномірний тонкий мазок.

Якщо для забору матеріалу використовують стерильну пастерівську піпетку, її також тримають у правій руці і проводять через полум’я перед внесенням у пробірку. Тонкий кінчик піпетки після охолодження біля стінки пробірки занурюють у рідкий досліджуваний матеріал чи бульйонну культуру, тримаючи верхній кінець її відкритим. Після попадання в піпетку досліджуваного матеріалу чи культури верхній кінець її закривають вказівним пальцем, виймають з пробірки. Останню закривають і ставлять у штатив. На поверхню предметного скла з піпетки випускають краплю матеріалу і опускають її в дезрозчин. Простерилізованою бактеріологічною петлею роблять мазок.

Виготовлення мазків із харкотиння або гною. При готуванні мазків із матеріалів, які погано розтираються (гній, харкотиння), використовують два предметних скла. Невелику кількість матеріалу стерильною бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять на середину знежиреного предметного скла і покривають його другим склом так, щоб 1/3 верхнього і нижнього скла залишалась вільною. Обидва скла сильно затискають між пальцями, роздавлюють досліджуваний матеріал і за вільні кінці розводять їх у сторони. Таким способом одержують два однакових мазки.

Виготовлення мазків із крові. Стерильною голкою роблять прокол пучки 4-го пальця лівої руки. Після появи краплі крові до неї торкаються поверхнею біля краю знежиреного стерильного предметного скла, яке швидко кладуть на стіл. Краєм іншого трохи вужчого і шліфованого скельця торкаються краплі і нахиливши його під кутом 45° швидко і обережно проводять ним у напрямку до дальшого краю. Внаслідок капілярності кров захоплюється краєм верхнього скла і під час руху розмазується по нижньому склі (рис.8). Правильно виготовлений препарат виходить тонким, дещо просвічує та має жовтувате забарвлення.

Із крові виготовляють також препарат "товстої краплі". На предметне скло наносять роздільно 2-3 звичайні краплі крові, злегка змішують їх скляною паличкою, петлею або кутом іншого предметного скла так, щоб утворилось плоске кров’яне п’ятно діаметром біля 1,5 см. Такі препарати виготовляють зокрема при діагностиці малярії, поворотних тифів.

Мазки-відбитки роблять із органів трупів людей і тварин, харчових продуктів щільної консистенції (сир, м’ясо, шинка, ковбаса, риба та ін.), а також з поверхні молодих колоній грибів, актиноміцетів, рідше бактерій. Розжареним у полум’ї скальпелем припікають поверхню органа або харчового продукту. Потім стерильними ножицями з цієї ділянки вирізають шматочок тканини. Поверхнею зрізу торкаються предметного скла у 2-4 місцях, роблячи мазок-відбиток. Такі ж мазки-відбитки можна виготовити з ділянки шкіри або слизової оболонки. Притискання досліджуваного об’єкта до скла повинно бути строго вертикальним тривалістю 1-2 с. Мазки-відбитки з колоній роблять на покрівних скельцях.

Висушування і фіксування препаратів-мазків. Виготовлені мазки висушують при кімнатній температурі або в термостаті. Тонкі мазки швидко висихають на повітрі, більш товсті можна висушувати над полум’ям газового пальника. Предметне скло при цьому тримають за ребра 1-им і 2-им пальцями правої руки мазком догори. Щоб не допустити денатурації білків бактерій і порушення їх внутрішньої структури ступінь нагрівання контролюють середнім пальцем, який знаходиться під предметним склом.

Висушені препарати необхідно фіксувати до поверхні скла. Незафіксований мазок є заразним, тому при роботі з ним треба бути дуже обережним, не торкатись до нього руками. При фіксації одночасно відбувається прикріплення бактерій до скла та їх знезараження. До того ж вбиті мікроорганізми значно краще забарвлюються.

У лабораторній практиці найпоширенішим методом фіксування мазків є фламбування – тобто фіксація в полум’ї газового пальника або спиртівки. При цьому мазок тримають так само, як при висушуванні і тричі проводять його через полум’я. Весь процес фіксації триває 5-6 с, а дія жару – 2 с. Більш тривале фіксування жаром зменшує якість препарату, а недофіксований мазок при наступній обробці змивається і таїть в собі небезпеку зараження.

При вивченні деяких структур мікробних клітин, а також мазків крові, відбитків органів використовують такі фіксуючі рідини як етанол (протягом 10-15 хв), метанол (5 хв), ацетон (5 хв), суміш Никифорова (10-15 хв), пари формаліну або осмієвої кислоти (декілька секунд). При такому обережному фіксуванні значно краще зберігаються і виявляються всі структури клітин і бактерій.

Забарвлення препаратів-мазків. Морфологію бактерій вивчають, як правило, на зафіксованих і забарвлених препаратах. Незабарвлені мікроорганізми, за виключенням грибів, погано видимі у світловому мікроскопі із-за їх малої контрастності. Для фарбування мазків у бактеріологічних лабораторіях широко вживають анілінові барвники. Вони поділяються на кислі, нейтральні та основні. Останні добре забарвлюють як ядерний апарат, так і цитоплазматичні структури. Позитивно заряджена фарбуюча частина їх молекули швидше і повніше вступає в сполуку з негативно зарядженою бактерійною клітиною. Кислі ж барвники фарбують мікробів значно слабкіше. Здатність та індивідуальна особливість бактерій фарбуватись тими чи іншими барвниками називають їх тинкторіальними властивостями.

У повсякденній лабораторній практиці найчастіше вживають такі барвники: червоні – фуксин основний (діамантфуксин, солянокислий розанілін або парарозанілін), фуксин кислий, нейтральний червоний, сафранін, конго червоний; фіолетові – генціан-, кристал- і метил-віолет; сині – метиленовий і толуїдиновий синій, трипановий голубий; зелені – малахітовий, брильянтовий зелений; жовто-коричневі – везувін, хризоїдин та ін.

Основні види барвників, що застосовуються в мікробіологічній практиці:

Дають наступне забарвлення
червоне	голубе (синє)	фіолетове	жовто-коричневе	зелене
фуксин основний, нейтральний червоний, конго червоний	метиленовий та толуїдиновий синій	генціанвіолет, метиленовий фіолетовий	хризоїдин, везувін	брильянтовий зелений, малахітовий зелений

Для забарвлення мазків необхідно мати набір фарбуючих розчинів у флаконах з піпетками і гумовими балончиками. Їх зручно розміщувати у дерев’яному штативі (колодці з гніздами). Змивання барвників і прополоскування препаратів роблять за допомогою спеціальних пристроїв (рис.).

Запропоновані численні методи забарвлення бактерій. Вони поділяються на прості й складні.

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів	\|	Прості способи забарвлення бактерій

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.006 сек.