Мікроскопічне дослідження живих мікробів.

Для прижиттєвого вивчення мікроорганізмів використовують методи надавленої й висячої краплі та спеціальні камери для тривалого спостереження за їх ростом, розмноженням, дією різних хіміотерапевтичних препаратів тощо. Перевагою цих методів є можливість досліджувати бактерії в неушкодженому вигляді, тоді як обробка мазків при їх висушуванні, фіксації та забарвленні часто супроводжується зміною мікробних клітин. Значно легше, простіше і швидше можна виявити рухливість, що свідчить про наявність джгутиків. Цим широко користуються в практичних лабораторіях при диференціально-діагностичному визначенні видів збудників.

Однак, ці методи мають і ряд недоліків. У живих бактерій, що активно рухаються, важко виявляти деталі структури. При такому дослідженні можна мати лише загальне уявлення про їх морфологію. Разом з тим, дослідження у живому стані крупніших мікроорганізмів (гриби, найпростіші) дає змогу вивчати тонку структуру їх клітин краще, ніж в забарвлених препаратах. Ця перевага стає особливо виразною при дослідженні живих незабарвлених мікробів за допомогою фазовоконтрастної та аноптральної мікроскопії.

Необхідно завжди пам’ятати, що робота з живими збудниками більш небезпечна, вимагає виняткової обережності і навику. Після мікроскопії потрібно обов’зково занурювати препарати в дезинфікуючий розчин.

Надавлена крапля. На середину предметного скла бактеріологічною петлею або піпеткою наносять краплю молодої (12-18 год) теплої бульйонної культури або іншого досліджуваного матеріалу. При густому рості культури її розбавляють фізіологічним розчином, так як наявність великої кількості мікробних тіл у полі зору утруднює спостереження за окремими бактеріями та їх рухливістю. Нанесену краплю накривають покрівним скельцем, обережно накладаючи його пінцетом, щоб у надавленій краплі не появлялись бульбашки повітря. Для цього покрівне скельце краще не накладати зверху, а ставити його ребро біля краю краплі і повільно опускати, витісняючи повітря між предметним і покрівним скельцями. Вдало зроблена крапля заповнює весь простір між ними, але при цьому рідина не виступає за краї покрівного скельця. Якщо вона виступає, зайву її частину відсмоктують шматочком фільтрувального паперу, утримуючи його пінцетом, після чого папір занурюють у дезинфікуючий розчин. Недоліком надавленої краплі є її швидке висихання. При необхідності довго розглядати препарат, краї покрівного скла заздалегідь змащують вазеліном.

Висяча крапля – метод мікроскопічного дослідження живих мікроорганізмів, розроблений Р.Кохом у 1876 р. За його допомогою можна спостерігати розмноження бактерій, характер їх рухливості, проростання спор у вегетативні форми, явище хемотаксису, дію фізичних і хімічних факторів, імунних сироваток тощо. Його також широко використовують для вивчення морфології грибів, найпростіших і спірохет. Як і в методі надавленої краплі, досліджують молоді культури, вирощені в рідкому або на щільному середовищі.

Для виготовлення висячої краплі необхідні спеціальні предметні скельця, в центрі яких є напівсферичне заглиблення (лунка). Невелику краплю негустої суспензії бактерій петлею або піпеткою наносять на середину чистого, але не знежиреного покрівного скельця. Предметне скло з лункою, краї якої попередньо змащують вазеліном, обережно накладають на покрівне скельце, слідкуючи щоб крапля культури знаходилась в центрі заглиблини, і швидко перевертають його. Крапля повинна звисати в лунці, але не торкатись її дна. Звідси походить назва препарату висяча крапля. Змащування країв лунки вазеліном створює своєрідну герметичну вологу камеру. Така крапля не висихає і придатна для спостереження протягом довгого часу.

Мікроскопічне дослідження живих об’єктів як в надавленій, так і висячій краплях проводиться за допомогою сильних сухих або імерсійних систем при опущеному конденсорі, звуженій діафрагмі та освітленні плоским дзеркалом. Спочатку при малому збільшенні (х8) знаходять край краплі, чітко видимий як лінія в дещо затемненому полі зору. По один бік цього краю є багато дрібнесеньких краплинок конденсату, які осіли на внутрішній поверхні покрівного скельця. По другий бік лінії видно рівномірний сіруватий фон. Це й є крапля. Знайдений край краплі переміщують у центр поля зору мікроскопа й переходять на сильніший сухий (х40), а при потребі й на імерсійний об’єктив (х90). Трохи відкривають діафрагму конденсора й починають спостерігати характер руху. Рухливі бактерії проходять з однаковою швидкістю значну віддаль, часом через усе поле зору, роблячи кругові та гвинтові рухи. Найбільш швидкі й прямолінійні рухи роблять монотрихи й лофотрихи. Перитрихам і амфітрихам властива менш енергійна й безладна рухливість. Мікроскопіст-початківець може помилково прийняти молекулярний (броунівський) рух за справжній. При цьому нерухливі бактерії постійно коливаються між двома близькими точками, ніби "танцюють" на місці.

Одним із суттєвих недоліків методу висячої краплі є слабка чіткість контурів мікробів із-за кривизни лунки. Для усунення цього недоліку можна користуватись камерою Беттхера. Її легко виготовити в будь-якій лабораторії. До звичайного предметного скла за допомогою воску, парафіну або відповідного клею прикріплюють скляне або пластмасове кільце з діаметром отвору біля 10 мм і висотою 6-7 мм. Верхній край приклеєного кільця змащують вазеліном і на нього накладають покрівне скельце з живими бактеріями в краплі, що звисає донизу в цій вологій камері. За допомогою такої камери можна навіть проводити цейтраферну кінозйомку живих об’єктів.

Для збільшення контрастності досліджуваних об’єктів в надавленій чи висячій краплях можна застосувати прижиттєве (вітальне) забарвлення. Для цього використовують малотоксичні й майже нешкідливі барвники: метиленовий і толуїдиновий синій, конго і нейтральний червоний, акридиновий оранжевий, янус зелений та ін. Суспензію мікробів вносять у краплю 0,001 % водного розчину барвника, готують надавлену або висячу краплю і мікроскопують.

Можна проводити прижиттєве забарвлення бактерій і флуорохромами. Тоді дослідження проводять за допомогою люмінесцентної мікроскопії.

Ще кращі можливості для довготривалого вивчення живих мікроорганізмів створюються у спеціально сконструйованих камерах. Найбільш відомі з них запропонували Пешков і Фонбрюн.

Ш-подібна камера Пешкова. На предметне скло наливають шар розтопленого агару товщиною 0,2 мм. Після застигання стерильним скальпелем вирізають дві канавки, як показано на рис. 11, і отримують Ш-подібний шар середовища. Посів мікробів проводять методом стікаючої краплі лише на середню смужку агару і негайно закривають стерильним покрівним скельцем. Середовище, що виступає за межі покрівного скла, обрізають і розтопленим парафіном герметично закривають краї препарату. Смужка агару, що межує з боків із повітрям канавок, гарантує нормальний розвиток аеробних і факультативно анаеробних мікробів.

Масляна камера Фонбрюна. На предметному склі товщиною 0,5 мм за допомогою густого спиртового розчину Шеллака приклеюють дві вузенькі скляні смужки такої ж товщини на відстані 10 мм одна від одної. Покрівне скельце з тонким шаром засіяного мікробами агару накладають на скляні бортики попередньо змазані сумішшю воску й каніфолю. Гумовою грушею продувають камеру, щоб випарувати конденсаційну вологу, і пастерівською піпеткою негайно заливають її вазеліновим маслом, обережно підпускаючи його під покрівне скельце. Масло заливають доти, поки весь шар агару знизу буде ним покритий. Краплю масла не слід доводити до країв камери, необхідно завжди залишати невеличкий зазор.

За допомогою камер Пешкова й Фонбрюна можна вивчати найтонші зміни клітинних структур при розмноженні бактерій і проводити їх цейтраферну кінозйомку особливо при використанні фазовоконтрастної й аноптральної мікроскопії.

Макроскопічне виявлення рухливості бактерій. Окрім забарвлення джгутиків, дослідження за допомогою надавленої та висячої крапель, рухливість мікроорганізмів можна досить просто встановити й неозброєним оком. Для цього досліджувану культуру сіють уколом у стовпчик напіврідкого живильного середовища. Посів інкубують у термостаті протягом 18-20 год. Якщо бактерії не мають джгутиків, їх ріст (інтенсивне помутніння) буде тільки впродовж лінії уколу. Рухливі бактерії дадуть дифузний ріст по всій товщі живильного середовища.

Лабораторна робота № 5

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Виготовлення барвників для фарбування за методом Нейссера.	\|	Вирощування мікроорганізмів

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.