Біохімічна ідентифікація бактерій за допомогою тест-систем

Інші варіанти подібних тест-систем передбачають адсорбцію диференціюючих субстратів на паперових або полімерних носіях. Серед них розповсюджені системи Auxtab, Minitek, Morlok, Micro-ID.

Подібні системи зручні в користуванні, вони дозволяють одночасно дослідити широкий спектр мікробних ознак, завжди готові до використання в будь-яких мікробіологічних лабораторіях, вони прості й надійні, вимагають невеликих об’ємів посівного матеріалу, тому економлять лабораторний посуд, піпетки. Комп’ютерна обробка одержаних результатів дає змогу швидко визначити й оцінити вид невідомого збудника.

Виготовлення живильних середовищ. До складу будь-яких середовищ входять переважно натуральні тваринні або рослинні продукти і компоненти – м’ясо, рибна мука, яйця, молоко, кров, дріжджовий екстракт, картопля тощо. З них готують спеціальні напівфабрикати у вигляді екстрактів, настоїв, ферментативних і кислотних гідролізатів (м’ясна вода, дріжджовий екстракт, триптичний гідролізат Хоттінгера, пептон та інші), які є основою для подальшого конструювання живильних середовищ. Крім цього, в живильні середовища додають різні неорганічні солі залежно від потреб мікробної клітини. Як прaвило, концентрація хлориду натрію складає 5,0 г/л, KH₂PO₄ – 0,2-0,5 г/л, MgSO₄·7H₂O, інші солі додаються із розрахунку 0,001 г/л. У необхідних випадках до складу вводять вуглеводи (цукри, багатоатомні спирти), амінокислоти в концентрації 0,5-1,0 %, а також вітаміни (до 0,001 мг/мл).

Для забезпечення необхідної густини середовища використовують агар-агар, який одержують з морських водоростей. Він є зручним і необхідним компонентом середовищ, оскільки не споживається бактеріями як ростовий субстрат. Утворюючи у воді гель, він плавиться при температурі біля 100 °С, а густіє при 40 °С. Джерелом желатину є багаті на колаген субстрати. Серед них хрящі, сухожилки, кістки тощо. Гель, який отримують внаслідок використання желатину, плавиться при температурі біля 32-34 °С і гусне при 28 °С. Проте численні мікроорганізми здатні розщеплювати желатин, тому використання останнього як наповнювача середовища вважається недоцільним. Найчастіше такі середовища з желатином застосовуються для визначення протеолітичних властивостей бактерій.

Виготовлення живильних середовищ є складним динамічним процесом, який потребує уваги бактеріолога. Цей процес складається з декількох основних етапів. Спочатку до дистильованої води згідно з прописом додають необхідні сухі компоненти середовища, ретельно перемішують, розчиняючи при нагріванні. Обов’язково встановлюють рН середовища, яке визначають або за допомогою іонометра, або індикаторними папірцями. При цьому слід звернути увагу, що після стерилізації реакція середовища падає на 0,2. Середовища, які містять агар, фільтрують через ватно-марлевий фільтр у гарячому стані, рідкі середовища – через паперові фільтри. Якщо є необхідність, їх освітляють осадженням або за допомогою білка курячого яйця чи сироватки. Середовища розливають у спеціальні матраци, колби, флакони і закривають ватно-марлевими пробками з паперовими ковпачками. Залежно від складу середовища використовують різні режими стерилізації. Так, середовища, які містять вуглеводи, желатин стерилізують в автоклаві 15 хв при температурі 112 °С або текучою парою при температурі 100 °С дробно. Середовища без вуглеводів можна стерилізувати в автоклаві при 115-120 °С протягом 20 хв. Якщо до складу середовищ входять нестійкі до температури компоненти, такі, як нативний білок, сироватка, сечовина, то вони стерилізуються або фільтруванням через бактеріальні фільтри, або їх додають готовим у стерильне середовище. Контроль стерильності середовищ здійснюють шляхом витримування їх у термостаті протягом декількох діб при температурі 37 °С.

Наводимо приклади виготовлення деяких простих живильних середовищ, які найчастіше використовуються в мікробіологічній практиці і можуть бути основою для виготовлення більш складних.

М’ясна вода. Для її виготовлення використовують свіжу яловичину, яку попередньо очищають від жиру, фасцій, сухожилків тощо, розрізають на дрібні шматки і пропускають через м’ясорубку. Отриманий фарш заливають водопровідною водою в співвідношенні 1:2, розмішують і на добу залишають у прохолодному місці. Отриманий настій кип’ятять протягом 30-60 хв, періодично знімаючи накип, а потім відстоюють. Відділяють рідину від фаршу, фільтрують через фільтрувальний папір або полотно і доливають водопровідною водою до первинного об’єму, потім розливають у флакони і стерилізують при 1 атмосфері (температура 120 °С) протягом 30 хв. Стерильна м’ясна вода прозора, має жовтуватий колір, а на стінках флакона і на дні утворюється осад із білків, які згорнулись. Тому при подальшому використанні середовища його знову фільтрують. Активна реакція середовища – 6,2.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Щоб виготовити МПБ, до м’ясної води додають 1 % пептону і 0,5 % хлориду натрію, встановлюють необхідне рН за допомогою 20 % розчину NaOH і кип’ятять 30-40 хв, постійно перемішуючи. Бульйон фільтрують через паперовий або полотняний фільтри, розливають у флакони, пробірки, перевіряють активну реакцію середовища і стерилізують при 120 °С протягом 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА).До м’ясо-пептонного бульйону додають дрібно нарізаний агар-агар (2-2,5 %). Одержану суміш кип’ятять до розчинення агар-агару, фільтрують, встановлюють рН і розливають у флакони. Стерилізацію проводять протягом 20 хв при температурі 120 °С.

Середовища з кров’ю, сироваткою або асцитичною рідиною.Оскільки ці середовища не можуть довго зберігатись, їх готують безпосередньо перед застосуванням. Для цього до розтопленого і охолодженого до 45-50 °С МПА додаютьстерильно 5-10 % свіжої або дефібринованої крові барана, кролика або іншої тварини. Флакони з агаром ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі, слідкуючи за відсутністю піни.

Ідентично готують сироватковий (5-10 % сироватки крові) або асцитичний агар (25 % асцитичної рідини).

Триптичний перевар за Хоттінгером. Бульйон із нього економічніший за інші м’ясо-пептонні середовища, оскільки дозволяє з однієї порції м’ясаодержати в декілька разів більше бульйону. У цьому середовищі міститься велика кількість амінокислот, отже, підвищується його буферність, і за рахунок цього більш стабільним є значення активної реакції середовища.

Для виготовлення перевару беруть один кілограм м’яса без сухожилків і жиру, порізаний на дрібні шматки розміром до 1-2 см, занурюють у каструлю з подвійним об’ємом води, яка кипить, і кип’ятять 15-20 хв, поки м’ясо не стане сірим, що свідчить про коагуляцію білків. Його виймають з рідини і пропускають через м’ясорубку. У рідині, яка залишилась, встановлюють рН 8,0, опускають туди фарш і охолоджують до 40 °С. Потім додають 10 % (до об’єму рідини) свіжої підшлункової залози, попередньо очищеної від сполучної тканини, жиру і двічі пропускають через м’ясорубку. Замість залози використовують сухий препарат панкреатину (0,5 %). Одержану суміш ретельно збовтують і доводять рН до 7,8-8,0. Через 30 хв перевіряють рН. Якщо активна реакція середовища не змінюється в кислу сторону, це свідчить про недоброякісність ферменту. Коли рН середовища стабілізується, суміш переливають у великі бутлі, заповнюючи їх на 1/3. Додають до 3 % хлороформу, закривають посуд резиновими корками та інтенсивно збовтують для перемішування рідин. Надлишок парів хлороформу випускають. Через 1-2 год знову перевіряють рН середовища, встановлюючи його на 7,4-7,6. Отриману суміш залишають при кімнатній температурі на строк до 16 днів. Протягом перших 3-4 днів щоденно перевіряють і коригують рН середовища, а також збовтують флакони не менше, ніж 3 рази на добу. Пізніше цю процедуру можна не проводити і збовтувати середовище слід не так часто. За 1‑2 дні до закінчення циклу перетравлювання збовтування середовища припиняють.

Про завершене якісне переварювання свідчать просвітління рідини, яка набуває солом’яно-жовтого кольору, а також утворення на дні пилоподібного осаду. Рідина легко фільтрується, її перевіряють на наявність триптофану за допомогою проби з бромною водою (до 3-4 мл фільтрату додають 3-4 краплі бромної води). За наявності триптофану (до 2,0-3,0 г/л) колір середовища змінюється на рожево-фіолетовий. Визначають загальний азот, який в нормі досягає 11,0-12,0 г/л, і амінний азот (до 7,0-9,0 г/л).

Гідролізат фільтрують через паперовий або полотняний фільтр, розливають у бутлі та автоклавують при 120 °С протягом 30 хв. У такому вигляді він може зберігатись тривалий час.

Його використовують для отримання бульйону Хоттінгера. З цією метою до 100-200 мл гідролізату додають 800-900 мл дистильованої води, 0,5 % хлориду натрію та 0,2 % однозаміщеного фосфорнокислого натрію. Доводять рН до 7,4‑7,6, розливають у флакони і стерилізують 20 хв при 120 °С.

М’ясо-пептонний агар на основі гідролізату Хоттінгера готують за рецептурою звичайного МПА.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватися стандартними сухими живильними середовищами, які випускає бактеріологічна промисловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіологічних досліджень і стандартизувати їх.

Для культивування бактерій широко застосовують безбілкові середовища, в яких добре ростуть багато органотрофних, у тому числі патогенних видів бактерій. До цих середовищ входить багато компонентів.

Культивування в синтетичних середовищах з використанням методу мічених атомів дає змогу детальніше диференціювати бактерії за характером їх біосинтезу.

Для диференціації прототрофних і ауксотрофних бактерій широко використовують селективні середовища. Прототрофи ростуть на мінімальному середовищі, яке містить тільки солі й вуглеводи, оскільки вони самі можуть синтезувати потрібні їм для розвитку метаболіти, тоді як ауксотрофи потребують середовища, що містить певні амінокислоти, вітаміни й інші речовини.

На густих живильних середовищах бактерії утворюють різні за формою й величиною колонії — видимі скупчення мікроорганізмів одного виду, що формуються в результаті розмноження з однієї або кількох клітин.

У лабораторних умовах бактерії вирощують у пробірках, чашках Петр і, у флаконах.

В інститутах, які виготовляють вакцини й сироватки, мікроорганізми культивують глибинним способом, що дає змогу раціональніше використовувати поживний субстрат і одержувати бактеріальну масу у великій кількості. Культури вирощують у реакторах з великим об'ємом поживного середовища. Аерування досягають пропусканням струменя повітря через товщу середовища. Метод аерування використовують і для лабораторних досліджень з метою швидкого вирощування аеробних бактерій та вивчення деяких процесів обміну речовин.

В умовах лабораторії анаероби вирощують у стаціонарних анаеростатах або портативних мікроанаеростатах з розрідженням повітря до 1—8 мм або в вакуум-ексикаторах.

Культивування анаеробів можливе в умовах заміщення кисню атмосферним азотом або іншим інертним газом. Анаеробні умови можна створити і простішими способами: за допомогою вазелінового масла, яке вміщують шаром поверх живильного середовища, або висіванням матеріалу в товщу агару. Застосовують спеціальні скляні трубки, які заповнюють МПА і запаюють на кінцях. Вирощують анаероби звичайно в середовищах Кітта — Тароцці, Вільсона — Блера та ін.

Лабораторна робота № 6.

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Класифікація живильних середовищ	\|	Методи знезаражування біологічних об'єктів.

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.006 сек.