• Гідрологія і Гідрометрія
• Господарське право
• Економіка будівництва
• Економіка природокористування
• Економічна теорія
• Земельне право
• Історія України
• Кримінально виконавче право
• Медична радіологія
• Методи аналізу
• Міжнародне приватне право
• Міжнародний маркетинг
• Основи екології
• Предмет Політологія
• Соціальне страхування
• Технічні засоби організації дорожнього руху
• Товарознавство продовольчих товарів

Тлумачний словник
Авто
Автоматизація
Архітектура
Астрономія
Аудит
Біологія
Будівництво
Бухгалтерія
Винахідництво
Виробництво
Військова справа
Генетика
Географія
Геологія
Господарство
Держава
Дім
Екологія
Економетрика
Економіка
Електроніка
Журналістика та ЗМІ
Зв'язок
Іноземні мови
Інформатика
Історія
Комп'ютери
Креслення
Кулінарія
Культура
Лексикологія
Література
Логіка
Маркетинг
Математика
Машинобудування
Медицина
Менеджмент
Метали і Зварювання
Механіка
Мистецтво
Музика
Населення
Освіта
Охорона безпеки життя
Охорона Праці
Педагогіка
Політика
Право
Програмування
Промисловість
Психологія
Радіо
Регилия
Соціологія
Спорт
Стандартизація
Технології
Торгівля
Туризм
Фізика
Фізіологія
Філософія
Фінанси
Хімія
Юриспунденкция

Етапи видiлення чистих культур мiкроорганiзмiв

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.

У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватно-марлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу – одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

На другий день (ІІ етап дослідження) на поверхні щільного живильного сере­довища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія – це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній дослі­джують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії.

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діаметром) їх поділяють на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і мутними.

За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, краплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска се­рединою.

Поверхня колоній може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth – гладенький), а шорсткі – R-форми (rough – шорсткий, нерівний).

Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість тощо.

Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії. Їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вив­чен­ня морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухо­мість бактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.

Рештки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватись стандартними сухими живильними середовищами, які випускає мікробіологічна промисловість. Такі середовища дозволяють суттєво покращити результати мікробіологічних досліджень і стандартизувати їх.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не змінюватись або набуває кольору пігменту. Такий характер росту найчас­тіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в’язким, слизистим та ін. Середовище над ним може залишатись прозорим або ставати мутним. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії.

Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, слизисту консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

У разі потреби виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується під мікроскопом, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного живильного середовища для одержання ізольованих колоній.

На третій день (ІІІ етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні.

Найчастіше досліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолі­тичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетворення нітратів у нітрити тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.

Для дослідження здатності бактерій розщеплювати білки (протеолітичні властивості) використовують молоко або середовище з желатином. Протеоліз у молоці виражається розчиненням згустка казеїну, який утворено бактеріями, що згортають молоко.

Середовища із желатином готують на м’ясній воді, додаючи 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрію та 10-20 % желатину. Посів роблять уколом. Протеоліз проявляється розрідженням стовпчика середовища. Оскільки деякі види бактерій відрізняються за особливостями розрідження желатину, цю ознаку можна враховувати при їх ідентифікації.

Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони – продукти неповного гідролізу білка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. Їх засівають мікроорганізмами, а потім визначають утворення кінцевих продуктів – аміа­ку, сірководню та індолу. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та притискають пробкою червоний лакмусовий папірець. В атмосфері аміаку він набуває синього забарвлення. Індикатором на сірководень є розчин ацетату свинцю, який за аналогічних умов визначення забарвлює фільтрувальний папір, змочений індикатором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю.

Індол можна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоченого 12 % розчином щавелевої кислоти. За наявністю індолу папірець набуває рожевого кольору. Більш чутливим є метод Ерліха. Згідно із загальноприйнятим методом пробкою пробірки притискають папірець, просякнутий спеціальним індикатором (спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу колір його змінюється на бузково-рожевий або малиновий. В іншому варіанті визначення індолу до 48-годинної бульйонної культури бактерій додають 1-2 мл сірчаного ефіру, а потім – реактив Еріха. У нижній частині шару ефіру за 1-2 хв з’являється яскраве малинове кільце.

У мікробіологічній практиці широко використовуються диференційно-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, які дозволяють виявити розкладання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну диференціацію бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого виділення чистих культур з їх наступною ідентифікацією. Ці середовища є елективними для багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються вони у сухому вигляді, тому їх приготування в лабораторіях не потребує багато часу.

Середовище Ендо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та індикатора фуксину, знебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище має слабке рожеве забарвлення. При рості лактозопозитивних мікроорганізмів, тих, що розщеплюють лактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-червоний колір з металевим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмонели, шигели) на цьому середовищі безбарвні.

До складу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений фосфат калію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має фіолетовий колір. Колонії лактозопозитивних бактерій мають темно-синє забарвлення, а лактозонегативні – рожевий відтінок.

Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) містить у складі агар із солями жовчних кислот лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. Мікроорганізми, що розщеплюють лактозу, утворюють колонії рожевого кольору, а ті, що її не ферментують – безбарвні.

У мікробіологічній практиці часто виникає потреба дослідити ферментацію не тільки одного, а декількох цукрів відразу. З цією метою використовують середовища Гісса. Вони можуть мати рідку та напіврідку консистенцію.

Основою рідкого середовища є 1 % пептонна вода з 0,5 % натрію хлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.). До ньогододають індикатор Андреде (кислий фуксин в 1 н розчині NaOH). Встановлюють рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з різними вуглеводами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок – запаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. Стерилізують парою під тиском 0,5 атм 15 хв.

Після посіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спостерігають появу червоного забарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утворення кислоти), а деколи з поплавка витісняється рідина. Тоді роблять висновок про утворення газу. Отже, можливі три варіанти при обліку результатів посіву на середовише Гісса: мікроорганізми не ферментують субстрату (негативна відповідь) або бактерії розкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти без газу чи кислоти і газу.

Враховуючи, що мікроорганізми по-різному діють на вуглеводи (розкладають або не розкладають), при кінцевому обліку результатів спостерігають пробірки із зміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строкатості, а такий ряд називають строкатим рядом Гісса.

Зараз у більшості випадків користуються набором сухих середовищ для визначення цукролітичних ферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. На відміну від попередньої групи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водного голубого з розоловою кислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки або розриви живильного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з індикатором ВР воно стає синім, а при підлужнюванні – червоним (бромкрезоловий пурпурний при утворенні кислоти дає дещо фіолетове та лимонно-жовте забарвлення, а бромтимоловий синій – зеленкувате або лимонне). У лужному середовищі вони мають відповідно інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.

Випускаються також сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною Олькеницького.

Середовище Рессела є напіврідким агаром із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %) та індикатором ВР. Після розливання його у пробірки їх кладуть так, щоб утворився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії ферментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьому випадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спосте­рігають за появою його бульбашок або розривами агару.

Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького – більш складне середовище порівняно з попереднім. Він дозволяє визначити ферментацію лактози, сахарози, глюкози, утворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. До складу середовища відповідно вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор феноловий червоний. Готове середовище має блідо-рожевий колір.

При розщепленні цукрів феноловий червоний забарвлює середовище в жовтий колір. Оскільки глюкоза наявна в невеликих концентраціях (0,1 %), в аеробних умовах (скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години росту. Через 18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу. При цьому утворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому червоного кольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що там зберігаються кислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН.

Ентеробактерії, які розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середовище в усій пробірці (жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лактози (1 %) в 10 разів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще невичерпані, тому зберігається жовтий колір середовища. Однак через 48 год за рахунок розщеплення пептонів можна спостерігати за його почервонінням (зсув рН у лужну сторону).

Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, водень) при ферментації цукрів, з’являються розриви середовища або відбувається скупчення газу на дні, що піднімає агар у пробірці.

Сірководень мікроби утворюють з неорганічних сполук, завдячуючи ферменту тіосульфатредуктазі. Взаємодіють із сірководнем солі заліза, які, вступаючи з ним у реакцію, утворюють сульфід заліза у вигляді нерозчинного преципітату чорного кольору в стовпчику.

Уреаза, яку продукують бактерії, руйнує сечовину з виділенням великої кількості аміаку, під впливом якого все середовище червоніє. Тому при наявності уреазопозитивних штамів провести облік ферментації цукрів неможливо. В таких випадках необхідно використовувати інші середовища.

За останні роки в практиці мікробіологічних лабораторій почали використовувати спеціальні тест-системи для визначення різноманітних властивостей бактерій: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластини та диски індикаторні біохімічні. Вони зручні для користування, надійні, дозволяють визначати 12-20 і більше різноманітних ознак, значно полегшити ідентифікацію мікробів (див. вкл., рис. 7).

Гемолітична активність мікроорганізмів є однією з найсуттєвіших ознак їх вірулентності, тому її визначення стало рутинною процедурою будь-якої спеціалі­зованої лабораторії. З цією метою використовують кров’яний МПА. Його готують з розтопленого та охолодженого до 45-50 °С живильного агару, до якого додають 5-10 % дефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з кров’ю ретельно перемішують, не допускаючи утворення піни, і розливають у чашки Петрі. Якщо бактерії продукують гемолізини, навколо колоній або штрихів посіву утворюються зони просвітління на матовому червоному фоні (див. вкл., рис. 8). За кольором гемолізу (безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип гемолізинів (a, b, g тощо).

Щоб виявити ліполітичні властивості мікробів, до складу живильних середовищ вводять ліпіди або жироподібні субстанції – твіни. Бактерії за таких умов утворюють райдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.

Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу середовищ барвники (метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. Фіксуючи час зміни кольору індикатора, можна судити про ступінь вираження редукуючої активності.

Декарбоксилазну активність бактерій оцінюють на спеціальних середовищах з амінокислотами (лізином, орнітином, глютаміновою кислотою та ін.) і відповідними індикаторами.

З метою встановлення видової належності бактерій часто вивчають їх антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними властивостями. ­Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні субстанції. Зокрема, представники родини ентеробактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели) містять оболонковий О-антиген, джгутиковий Н-антиген і капсульний К-антиген. Вони не­однорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох варіантах. Їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Таке визначення виду бактерій носить назву серологічної ідентифікації. Його відносять до одного з головних методів встановлення виду виділеної культури. Найчастіше використовується орієнтовна реакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), а потім у кожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації. ­Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента. При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера).

При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію проводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на визначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.

Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об’єкти – найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.

Дуже важливим при виділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар, диско-дифузійний метод). Для цього на поверхню спеціального щільного живильного середовища в чашках Петрі засівають культуру мікроорганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіотиками. Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів.

На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або “Виділений збудник належить до виду Staphylococcus epidermidis”.

Запам’ятайте етапи виділення чистих культур аеробних бактерій:

1 - макро- i мiкроскопiчне вивчення дослiджуваного матерiалу i посiв на щiльнi поживнi середовища для одержання окремих колонiй.

2 - макро- i мiкроскопiчне вивчення колонiй i пересiв на скошений агар;

3 - перевiрка культури на чистоту та її iдентифiкацiя;

4 - висновок про видiлену культуру.

Переглядів: 22568