Біотехнологія трансплантації ядер

Більшість досліджень, виконаних в останні роки з гібридизації соматичних клітин еукаріотичних організмів (переважно ссавців) у клітинній культурі, переконливо довели, що в гібридній клітині, які має змішаний геном у зв'язку з гетерогенною природою батьківських клітин, відбуваються стабільні зміни в експресії генів синкаріона порівняно з процесом експресії у вихідних батьківських клітинах. Так, при злитті клітин щурячої гепатоми, що синтезує і екскретує альбумін, з мишачими фібробластами, що не секретують цей білок, були отримані гібридні клітини, частина клонів яких синтезували альбумін тільки пацюка, чи тільки миші, або альбуміни обох вихідних батьків (пацюка і миші).

На підставі результатів цього й інших подібних експериментів з гібридизації соматичних клітин було висловлене припущення про те, що в клітинах ссавців є речовини, здатні прямо чи побічно впливати на клітинне ядро, змінювати його функціональний стан за допомогою позитивної або негативної регуляції експресії певної частини генів. Однак комплекс об'єктивних причин (гетерогенність генома найчастіше зі значним дефіцитом хромосом, а також із хромосомними перебудовами, що відбулися, які знаходяться в оточенні гетерогенної цитоплазми), властивих методу гібридизації соматичних клітин, не дозволив ідентифікувати речовини, що беруть участь в експресії генома, а також установити їхню хімічну будову і механізм дії. До цього часу вчені мали у своєму розпорядженні дані про те, що речовини, які містяться в цитоплазмі тварин, беруть участь у регулюванні експресії генів клітинного ядра.

Виявилося, що в ядрах попередньо вилучених з диференційованої клітини і поміщених у цитоплазму яйцеклітини починалися процеси клітинного диференціювання і в багатьох випадках розвивався нормальний організм, тобто ядра спеціалізованих клітин містили повний обсяг необхідної для розвитку повноцінного організму інформації. Так, злиття ядер, вилучених з клітин кишкового епітелію пуголовка, з позбавленої ядра яйцеклітиною в багатьох випадках приводило до розвитку жаби. Ці експерименти, виконані на амфібіях, показали, що цитоплазма регулює активність ядра; у спеціалізованих клітинах багато функцій ядра гальмуються компонентами цитоплазми.

Методи енуклеації, застосовані для одержання каріопластів, відрізняються від тих прийомів, що забезпечують успіх при одержанні цитопластів. Клітини, призначені для виділення ка-ріопластів, за 2 дні до енуклеації висівають на вирізані з культу-ральних флаконів пластикові пластинки, які перед поміщенням у 50-мілілітрову центрифужну пробірку, заповнену звичайним поживним середовищем, складали так, щоб їхні поверхні з прикріпленими клітинами знаходилися зовні. Мишачі фібробласт-ні лінії А9 центрифугували при 9,5 тис. § і 35 °С протягом 15 хв. Призначення цієї процедури зводилося до того, щоб в осаді ка-ріопластів, який має бути отриманий, зменшити кількість цілих клітин. Після відокремлення слабко прикріплених до субстрату клітин, пластинки з клітинами моношару, що залишилися, переносили в пробірки, де концентрація цитохалазину В з розрахунку на 1 мл звичайного поживного середовища досягає 10 мкг. Вміст пробірок інкубували при 37 °С протягом 15 хв; тривалість центрифугування при 35 °С і 7 тис. об./хв — 45 хв. Надосадову рідину, що утворилася, зливали, а осад, представле- ний в основному каріопластами, ресуспендували в звичайному поживному середовищі.

У виготовлених за описаною методикою препаратах каріопластів знаходяться фрагменти цитоплазми, каріопласти, що загинули, та цілі клітини.

Властивості цитопластів і каріопластів. Установлено здатність цитопластів синтезувати білки, підтримувати реплікацію вірусу везикулярного стоматиту і поліовіруса, синтез РНК і білка, контрольований вірусом сказу, звільняти вірус 5У40 із трансформованих клітин. Цитопласти містять усі види органел, властиві нормальній клітині, зберігають характерну для цілих клітин здатність прикріплюватися до субстрату й утворювати складчасту мембрану, пересуватися і здійснювати піноцитоз.

Навколо каріопластів знаходиться шар, на частку якого припадає близько 10 % клітинної цитоплазми, що містить компоненти ендоплазматичного ретикулума, деяка кількість мітохондрій і рибосом; центріолі в каріопластів, на відміну від цитопластів, відсутні.

Близько 10 % каріопластів деяких клітинних ліній здатні відновлювати весь обсяг утраченої при енуклеації цитоплазми і знову перетворюватися на життєздатні клітини.

Здатність каріопластів регенерувати втрачену в процесі енуклеації цитоплазму і формувати життєздатні колонії клітин залежить від кількості цитоплазми, що оточує ядро. У фракції каріопластів, біля ядер яких зосереджено 2-4 % тієї кількості цитоплазми, що міститься в інтактній клітині (дрібні каріопласти), тільки один з 10⁶ очищених елементів може сформувати життєздатну колонію клітин.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Біотехнологія і гібридизація соматичних клітин	\|	Трансплантація ядер і реконструювання клітин.

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.005 сек.