Крок 4: Бібліотека скринінгу

Крок 3: Трансформація

Крок 2: Отримання кДНК з РНК

Створення бібліотек кДНК

Крок 1: Ізолювати РНК

РНК очистити від тканин або клітин

мРНК ізолювати від рибосомних і тРНК

Колонка з оліго dT використовується для зв'язування полі А

В основі кДНК бібліотеки є РНК, які очищають від тканин (наприклад, серця або шкіри) або з клітинної лінії. Щоб отримати тільки РНК (мРНК) і позбутися некодируючих РНК, таких як рибосомальна РНК і тРНК, для цього використовується оліго dT хроматографія. Для цього використовуються короткі відрізки нуклеотидів тимідину, які прив'язані до колонки або магнітні кульки. Оліго dT зв'язується з хвостом ПоліА, що знайдені знайдені на всіх РНК,. Елюція з колонки призводить до відносно чистої популяції молекул мРНК.

мРНК обробляють ферментом зворотної транскриптази.

Ферментні копії послідовності мРНК в перший ланцюг ДНК.

Інший фермент використовується, щоб зробити другий ланцюг кДНК.

Ізольовану мРНК потім інкубують з ферментом зворотної транскриптази. Цей фермент дає можливість скопіювати послідовність РНК в комплементарну ДНК (кДНК) . Для цього потрібна матрична РНК, праймер (як правило, оліго dT), і досить нуклеотидів. Після першого ланцюга кДНК, що був зроблений, РНК перетравлюється від використання ферменту РНКази H. Тоді інший фермент (або зворотної транскриптази) використовується для копіювання першого ланцюга, щоб зробити другий ланцюг кДНК.

Дволанцюгову кДНК вставляють в клонуючий вектор.

кДНК лігують в клоную чому векторі ( плазміді або фагові)

Вектор трансформують або інфікують ним бактерію.

Дволанцюгову кДНК лігують в клонуючий вектор. Цей вектор, як правило, є плазмі дою або вектор фага ,так як кДНК рідко перевищує 10 кб. Клони потім вводяться в бактерію шляхом трансформації у випадку плазміди або інфікуються в разі фага. В ідеальній бібліотеці, кожна колонія чи бляшка (plaque) містить різні клони, які виникли з однієї молекули мРНК. Насправді, бібліотека кДНК може сильно відрізнятися за якістю. Нерідкі випадки, коли значний відсоток клонів в бібліотеці не містятить вставки. В інших випадках, вставки можуть бути дуже короткими, що становить лише часткове копіювання РНК в кДНК.

Колонії ДНК прикріплені до мембрани

ДНК скринінг з міченими зондами

ДНК, радіактивно мічене

Мічене ДНК дозволяє гібридизацію ДНК на мембрані.

Після відмивання, позитивні точки(плями) гібридизації ідентифіковані.

Бібліотеки мають кілька потенційних застосувань. Найбільш поширеною є спроба ізолювати клон з послідовності, ідентичні або схожі на відомі фрагменти ДНК. Гібридизація, що дає взаємодоповнюючий характер для двох ланцюгів ДНК, використовується для пошуку в бібліотеці ідентичних або схожих послідовностей. Цей процес відомий як скринінг бібліотек. На екран (screen – ширма) бібліотеки, ДНК в кожній бактеріальній колонії спочатку прикріплюється до нейлону або нітроцелюлозної мембрани. Цей результат досягається шляхом розміщення мембрани над колоніями і дозволяючи їм прилипати до неї. Мембрану потім видаляють і обробляють пошкоджені клітини і прикріплене незворотньо ДНК, яка вивільняється з клітин. Зонди помічені і гібрідізовані з ДНК прикріплені до мембрани (описано далі в цій главі). Після промивання і впливу рентгенівської плівки, місце розташування колонії, що містять конкретні кДНК може бути візуалізоване.

Читайте також:

Тема 3. Робота шкільного бібліотекаря з бібліотечним фондом.

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Геномні бібліотеки	\|	Гібридизація

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.