• Гідрологія і Гідрометрія
• Господарське право
• Економіка будівництва
• Економіка природокористування
• Економічна теорія
• Земельне право
• Історія України
• Кримінально виконавче право
• Медична радіологія
• Методи аналізу
• Міжнародне приватне право
• Міжнародний маркетинг
• Основи екології
• Предмет Політологія
• Соціальне страхування
• Технічні засоби організації дорожнього руху
• Товарознавство продовольчих товарів

Моноклональні антитіла

План

1. Напрямки імунобіотехнології.

2. Вимоги до пухлинних клітин.

3. Методи гібридизації клітин.

4. Селективне середовище ГАТ.

5. Етапи отримання гібридом.

6. Використання моноклональних антитіл.

Напрямки імунобіотехнології:

1. Клонування лінії лімфоцітів в присутності факторів росту (інтерлейкінів).

Дія на Т-лімфоцити.

Нормальні лімфоцити, після активації мітогенами чи (і) антигенами, виробляють спеціальні імунофактори – лімфокіни, зокрема інтерлейкін-2.

Останні діючи на відповідні рецептори Т-лімфоцитів виділених з організму, стимулюють їх до багаторазової проліферації.

2. Трансформування лінії лімфоцитів вірусом Епштейна-Барр (ВЕБ).
Дія на В-лімфоцити.
ВЕБ, виділений з клітин африканської лімфоми, діє на В-лімфоцити, які трансформуються в лімфобластоїдні клітинні лінії.
Синтезовані цими клітинами препарати містять ВЕБ і тому їх не використовують для клініки а лише для діагностики.

3. Генетична інженерія імуноцитів.
Гени, що кодують продукцію антитіл, вводять в мієломні клітини. В результаті отримують химерні білки, окремі ділянки яких, після добудовування певних частин молекули є антитілами. (Від тварин можна отримати антитіла необхідні людині, або для іншого виду тварин).

4. Гібридоми

Тривало живучі культури гібридних клітин, що секретують антитіла визначеної специфічності

Суть методу:

Від імунізованої відповідним антигеном миші отримали лімфоцити, які “злили” із близькоспорідненою пухлинною клітиною. Отримані гібридоми синтезували і секретували специфічні антитіла, як перший з “батьків”, та необмежено ділились, як другий з батьків.

Вимоги до пухлинних клітин:

1. При об’єднаннні їхніх хромосом з хромосомами нормальних лімфоцитів не повинен порушуватись біосинтез антитіл чи імунофакторів. (Для цього найкраще придатні “родичі” генетично (сингенні) та “родичі” того ж типу тканинної диференціації (для В-лімфоцитів це плазмацитоми, для Т-лімфоцитів це Т-лімфоми).

2. “Легко” рости в культурі in vitro, щоб передати цю ознаку спадково гібридомам.

3. “Легко” рости в черевній порожнині сингенних тварин, щоб отримати гібридомні асцити.

4. Висока здатність до гібридизації (10-2 – із 100 клітин 1 утворює гібридому).

5. Мутанти по визначених генах, що контролюють експресію життєво-необхідних ферментів.

Методи гібридизації клітин:

1. Вірус Сендай – зараз не застосовують (біологічний).

2. Лізолецитин або поліетиленгліколь (хімічний).

3. Електричне або магнітне поле (фізичний).

У 2-3 рази ефективніше від хімічного методу. Процес можна контролювати під мікроскопом і відразу (без метаболічної селекції) відділяти гібридні клітини.

Відділення гідридом від батьківських клітин методом метаболічної селекції.
Середовище ГАТ (гіпоксантин-аміноптерин-тимідин).

• Для синтезу ДНК та РНК необхідні пурини. Основна їх кількіть синтезується з амінокислот та вуглеводів de novo.

• Лімфоцити мають ензим ГГФРТ (гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансфераза), який додатково обхідним шляхом забезпечує синтез пуринових нуклеотидів, що необхідні для синтезу ДНК та РНК.

• Пухлинні клітини ГГФРТ не мають.

• Компонент селективного середовища – аміноптеринблокує біосинтез пуринів (ГТФ, дГТФ, АТФ, дАТФ) та дТТФ de novo. Тому в такому середовищі, де ще буде гіпоксантин (субстрат для ГГФРТ) та тимідин(для синтезу дТТФ) виживуть лише лімфоцити та гібридні клітини, які успадкують від батьківських лімфоцитів цю властивість синтезу НК.

• Лімфоцити, що не утворили гібридом, мають тривалість життя лише кілька днів.

• Пухлинні клітини, що не у творили гібридом, в селективному середовищі загинуть.

• Виживуть лише гібридоми.

• Клітини мієломи і лімфоцити витримують від 1 до кількох хвилин у 40-50% розчині ПЕГ у фосфатному буфері.

• Розбавлення 10 кратним об’ємом культурального середовища і осадження клітин.

• Внесення клітин в чарунки де є: а) фідерні клітини (клітини перитонеального ексудату та клітини селезінки і тимусу – продукція в середовище факторів росту і фагоцитоз загиблих клітин; б) середовище ГАТ

• Через 7-14 днів виростають колонії гібридних клітин. (“Юні” гібридні клітини здатні “губити” окремі хромосоми, тому контролюють рівень антитіл).

• Через 3-4 тижні ГАТ замінюють на ГТ, а через кілька днів після цього на середовище без селективних добавок

• Клонування гібридних клітин.

Етапи отримання моноклональних антитіл:

1. Підбір або створення лінії пухлинних клітин.

2. Імунізація тварин і отримання лімфоцитів.

3. Підготовка культури фідерних клітин.

4. Гібридизація клітин

5. Селекція гібридних клітин.

6. Тестування гібридом на продукцію антитіл.

7. Клонування гібридом.

8. Провірка антигенної специфічності гібридомних антитіл.

9. Вирощування гібридом з мікрокультур у макрокультури.

10. Паспортизація гібридом і моноклональних антитіл.

11. Масове продукування гібридомних антитіл.

12. Очищення гібридомних антитіл.

13. Створення на основі отриманих моноклональних антитіл лікувальних чи діагностичних препаратів.

Використання моноклональних антитіл:

Читайте також:

1. Антигени. Антитіла. Серологічні реакції .
2. Моноклональні антитіла і гібридом на технологія

Переглядів: 3545