Складні методи забарвлення.

В мікробіологічній практиці важдиве значення мають складні методи фарбування, за допомогою яких можна виявити різноманітні клітинні структури та досконало вивчити морфологію мікроорганізмів.

При складних методах, які ще називають диференціально-діагностичними, використовують декілька різноманітних барвників, які дозволяють виявити особливості хімічного складу клітини або наявність у неї певних структур.
Для фарбування беруть розведені водно-спиртові або водно-фенолові розчини, які готують із насичених розчинів відповідних барвників.
Забарвлення мікроорганізмів за методом Грама.Метод Грама є найважливішим методом забарвлення мікробів і виявлення їх тинкторіальних властивостей. Він дозволяє поділити мікроорганізми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапляються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризуються як грамваріабельні.
Метод було розроблено Кристіаном Грамом у 1884 р. Однак до цього часу остаточно не з’ясовано механізми різного забарвлення мікроорганізмів. Вважають, що така здатність пов’язана з відмінностями у будові пептидоглікану в клітинній стінці грампозитивних бактерій, наявністю тейхоєвих кислот, вищою, порівняно з грамнегативними, концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнат магнію в клітині, співвідношенням РНК:ДНК в цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1), а також більш кислим значенням рН в ізоелектричній точці цитоплазми.
Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних бактерій здатні утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бактерій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнегативних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлюються фуксином в червоний колір.
Грампозитивними є стафілококи, стрептококи, пневмококи, сарцини і монококи, бацили і клостридії, а також дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативні - гонококи, менінгококи, кишкові палички, сальмонели, збудники дизентерії, рикетсії, всі звивисті бактерії та інші.
Методика забарвлення полягає в тому, що на фіксований препарат накладають клаптик фільтрувального паперу, на який наливають карболовий розчин генціанвіолету на 1-2 хв (у модифікації Синьова використовують суху полоску фільтрувального паперу, заздалегідь просочену 1 % спиртовим розчином кристалвіолету і висушену, на яку наливають 2-3 краплі води).
Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на 1 хв. Зливають розчин Люголя і знебарвлюють препарат спиртом до зникнення фіолетових струмочків барвника. Промивають його водою і додатково забарвлюють протягом 1-2 хв водним розчином фуксину Пфейффера. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують та мікроскопують.

Забарвлення кислотостійких бактерій. Кислотостійкі мікроорганізми (збудники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.) містять велику кількість високомолекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти. Вони з великим трудом фарбуються звичайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні їх концентрованим феноловим фуксином Циля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються розчинами кислот, лугів і спиртів. Клітини тканин, лейкоцити, слиз, інші бактерії при такій обробці легко віддають барвник. У зв’язку з цим при додатковому забарвленні препаратів метиленовою синькою всі ці елементи після знебарвлення мазків фарбуються в синій колір, а кислотостійкі бактерії залишаються червоними.

Метод Циля-Нільсена. Остаточний варіант методу автори запропонували в 1884 р. Техніка забарвлення включає декілька етапів:

1. На фіксований у полум’ї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із фарбою залишають ще на 1-2 хв для охолодження; зливають барвник, знімають папірець, промивають водою.

2. Препарат знебарвлюють 5 % сірчаною або соляною кислотою до появи жовтуватого відтінку (10-30 сек) і декілька разів промивають водою.

3. Додатково забарвлюють мазок метиленовою синькою Леффлера, промивають водою, висушують і досліджують під мікроскопом.

Мікроскопічна картина: на загальному синьому (голубому) фоні кислотостійкі бактерії виглядають рубіново-червоними.

Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудника прокази використовують метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розведеним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприймають забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.

При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу Циля-Нільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.

Фільтрувальний папір просочують концентрованим розчином фуксину Циля, висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дистильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним методом Циля-Нільсена.

Забарвлення за Романовським-Гімзою. Метод Романовського-Гімзи належить до складних методів фарбування. Він є одним із основних і найпоширеніших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фарбуються різні структурні елементи паразитів крові –малярійних плазмодіїв, трипаносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм, спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.

Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового синього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосередньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барвника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і висушують на повітрі. Приготовлений розчин наносять на мазок, а ще краще предметне скельце з мазком опускають у стаканчик з барвником. Забарвлення триває від 30 хв до двох і більше годин. Товсті краплі крові фарбують протягом 30 хв. Потім барвник зливають, препарати промивають водою і добре висушують на повітрі у вертикальному положенні. Мікроскопію проводять із використанням імерсійних об’єктивів.

Будучи в розчині синьо-фіолетовим поліхромний барвник Романовського-Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин і найпростіших, тіла бактерій, їх капсули, слиз – у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлюються в темний червоно-фіолетовий колір, а волютинові зерна – у вишнево-червоний; цитоплазма має рожевий відтінок.

Лабораторна робота № 4.

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Виготовлення барвників для простого забарвлення	\|	Забарвлення окремих структур мікробної клітини

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.016 сек.