Хід роботи

Розводять водою 5–10 мкг білка до кінцевого об’єму 1,0 мл. До отриманих розчинів додають 0,1 мл 0,15 % ДОХ і залишають на 10 хв при +20 °С. Після цього вносять 0,1 мл 72 % ТХО, перемішують і центрифугують упродовж 15 хв при 3 000 g. Рідину від осаду відділяють шляхом декантації (процедурою осадження можна знехтувати, якщо немає домішок або якщо у процесі вимірювання їхня наявність врахована). До осаду білка додають 1 мл води та 1 мл реагенту А. Перемішують до розчинення і залишають на 10 хв при +30 °С. Після 10 хв інкубації до проб додають 0,5 мл реагенту В і швидко перемішують. Через 30 хв вимірюють екстинкцію розчину при λ = 750 нм. Зменшення інтенсивності забарвлення в часі становить 1–2 % за годину при +20 °С. Залежність поглинання від концентрації білка в логарифмічних координатах є лінійною. Метод осадження білка ТХО з розчину в дезоксихолаті можна застосовувати до розчинних і мембранних білків. Білок у кількості 1–10 мкг визначають за цією методикою зі зменшенням об’ємів усіх реагентів уп’ятеро.

2.1.1.6. Електрофорез білків сироватки крові на папері

Суміш білків розділяють на спеціальних типах хроматографічного паперу, який просочують буферними розчинами, у приладах для електрофорезу. Білки розділяють за напруги до 500 В. Схема одного з можливих приладів для низьковольтного електрофорезу показана на рис. 2.10.

Рис. 2.10.Схема приладу для низьковольтного електрофорезу на папері:

1 – плексигласова ванночка та кришка; 2 – два електродні відділи; 3 – поздовжні перетинки в електродних відділах; 4 – кінці паперових смужок; 5 – горизонтальна пластинка з шипами; 6 – палички між горизонтальною пластинкою і зовнішніми електродними відділами; 7 – плексигласова пластинк а з великими круглими отворами

Камера для електрофорезу складається з плексигласової ванночки та кришки (1). У ванночці наявні два електродні відділи (2), кожний з яких додатково розділений поздовжньою перетинкою (3) ще на два відділи, з’єднані між собою. У внутрішні відділи опускають електроди, а у зовнішні – кінці паперових смужок (4). Основна частина паперу розташована на горизонтальній пластинці з шипами (5). Між горизонтальною пластинкою і зовнішніми електродними відділами розміщені палички (6), через які перекидають паперові смужки і які виконують функцію підтримувальних опор. Під верхньою кришкою камери розміщена плексигласова пластинка з великими круглими отворами (7), на яку зверху кладуть змочений у дистильованій воді та складений у чотири–п’ять разів фільтрувальний папір. Цей папір сприяє збільшенню герметичності камери і, як наслідок, зменшує випаровування рідини з електрофореграм під час електрофорезу.

Цим методом сироватку крові можна розділити на п’ять–дев’ять фракцій і визначити відносний вміст білка в кожній з них. Розділення проводять у буферному розчині (рН 8,6–8,9) з градієнтом потенціалу 3–5 В/см (120–350 В для смужок довжиною 40–45 см) за кімнатної температури. Сила струму не повинна перевищувати 0,1–0,3 мА на кожний поперечний сантиметр паперової смужки. Збільшення сили струму в понад два рази неприпустиме, оскільки відбувається надмірне нагрівання та значне випаровування буферного розчину і, як наслідок, пригорання паперу.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Реактиви	\|	Реактиви

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.013 сек.