Хід роботи

Отримання сироватки крові.Кров обробляють за такою методикою: 2–3 мл крові набирають у суху центрифужну пробірку і залишають на 30–60 хв. Тонкою скляною паличкою обережно обводять стінки пробірки для відділення від неї згустка, центрифугують, сироватку зливають у чисту пробірку.

Підготовка камери.Відділи для електродів наповнюють буферним розчином до одного рівня (щоб попередити перетікання буфера). У внутрішні частини електродних відділів встановлюють електроди. На аркуші хроматографічного паперу (18×45 см) (якщо використовують тонкий папір, то зразки ліпше наносити на окремі смужки шириною 4–5 см) на відстанні 15 см від одного з його вузьких країв простим м’яким олівцем (графіт перешкоджає розтіканню рідини) розкреслюють місця для нанесення проб. Їх креслять у формі прямокутників (2×0,3 см), більші сторони яких розміщують перпендикулярно до довжини паперової смужки. Відстань між стартовими зонами і краями електрофореграми повинна становити 2 см. Електрофореграму просочують буфером, у якому будуть проводити електрофорез. Для цього її протягують через кювету з буферним розчином. Кінці паперових смужок (6–8 см) не змочують. Надлишок буфера вилучають шляхом промочування смужок між двома–трьома шарами фільтрувального паперу. Вологу елктрофореграму поміщають у камеру на центральну горизонтальну пластинку, а кінці занурюють у зовнішні відділи електродних відділів. Прилад щільно закривають кришкою, під якою містяться змочені водою аркуші фільтрувального паперу.

Проведення електрофорезу.Після того, як паперові смужки повністю просочаться буферним розчином, на обкреслені ділянки наносять проби: 0,01–0,02 мл (1–2 мг білка) сироватки. Камеру закривають кришкою і приєднують до джерела струму. Тривалість електрофорезу становить 22–24 год за напруги 200–300 В.

Фіксація і зафарбовування електрофореграми.Після завершення електрофорезу від’єднують камеру від джерела струму й відразу виймають електрофореграму. Електрофоретичні смужки розкладають на спеціальні підставки і висушують під витяжкою, а потім у сушильній шафі за 105 °С протягом 20 хв для фіксації білків на папері. Згодом електрофореграму переносять до емальованого лотка, заливають барвником і залишають на 2–3 год або й більше. Фарбу зливають і електрофореграму відмивають від її надлишку, заливаючи три–чотири рази 2 % розчином оцтової кислоти, кожного разу на 5–10 хв. Ділянки паперу, які не містять білків, повинні бути повністю відмиті від фарби. Для закріплення зафарбованих продуктів електрофореграму на 2 хв заливають 2 % розчином оцтовокислого натрію і висушують на повітрі під витяжкою.

Визначення окремих білкових фракцій.При рН 8,6 білки сироватки крові заряджені негативно і переміщаються в електричному полі до анода. Найшвидше до анода рухається фракція альбумінів, а тоді α₁-, α₂-, β-, γ-глобуліни (рис. 2.11, а). Фрагменти паперових смужок, на яких проявилися білкові плямки, розділяють поперечними лініями простим олівцем на смужки шириною 3–5 мм і розрізають по цих лініях. Кожну смужку подрібнюють і вносять в окремі пронумеровані пробірки, заливають 3 мл 0,01 М розчину NaOH, залишають на годину для екстракції фарби з паперу, а тоді кожний розчин спектрофотометрують на ФЕКу при λ = 612 нм. Паралельно обробляють контрольну пробу. Для контролю вирізають фрагмент паперу на незафарбованій ділянці електрофореграми.

Рис. 2.11.Електрофорез сироватки крові на папері або на ацетилцелюлозі. Електрофореграма сироватки крові людини (а) і крива розподілу білкових фракцій на електрофореграмі (б)

На підставі отриманих даних (оптична густина кожного білкового зразка) будують криву розподілу зафарбованих продуктів на електрофореграмі. На осі абсцис позначають номери пробірок, а на осі ординат – відповідні значення оптичної густини (рис. 2.11, б). Розраховують відсоткове співвідношення білкових фракцій у сироватці крові. Для цього побудовану криву поділяють на мінімальні ділянки, які відповідають окремим фракціям. Значення площі кожної ділянки пропорційне до кількості фарби, яка взаємодіяла з білком цієї фракції. Співвідношення між цими площами обчислюють за масою (наважка ділянок паперу пропорційна до їхньої площі), всю площу приймають за 100 %. Замість паперу можна використовувати ацетилцелюлозу (див. рис. 2.11). У цьому випадку співвідношення білкових фракцій у сироватці крові можна визначити за денситограмою.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Реактиви	\|	Електрофорез білків сироватки крові в агаровому гелі

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.