Протопласти рослинних клітин як об’єкт біологічного конструювання

Культивування окремих клітин

Культивування окремих клітин дозволяє одержати клони та дослідити генетичну і фізіологічну стабільність або мінливість при вирощуванні клонового матеріалу.

Ізольовані протопласти застосовуються для клонової селекції мутантних, гібридних, трансформованих ліній. Як правило, в ці клітини вводять маркерні гени або створюють маркерні ознаки для забезпечення селективних умов відбору. Мацеровані клітини рослинних тканин є зручною моделлю для порівняльного вивчення фізіологічних процесів у тканині і в окремій тканинній клітині. Так, порівняння процесів фотосинтезу на рівні окремих клітин мезофілу листка на тканинному рівні викликає великий інтерес при вивченні фотодихання.

Разом з тим, при культивуванні цих клітин на середовищі, стимулюючому поділ клітин, вони диференціюють і утворюють колонії каллусних клітин. Нижче перераховані ферментні препарати і умови, при яких можна мацерувати тканину мезофіла листка та одержувати тканинні клітини.

Процедура ізолювання клітин мезофіла листка тютюну

1. Поверхнева стерилізація гіпохлоридом натрію (0,1 %-й розчин).

2. Промивання стерильною дистильованою водою 3 рази.

3. Стерильне видалення нижнього епідермісу в ламінар-боксі.

4. Нарізання фрагменту на смужки шириною 1мм та занурення в розчин для мацерації попередньо на 3 сек. з вакуум-фільтрацією.

5. Перенесення у свіжий мацеруючий розчин та інкубація протягом 20 хв. на гойдалці.

6. Фільтрування через шар батисту, промивання через нейлоновий фільтр (40 мкм).

Одержання протопластів Протопласти - обмежені мембраною, цитоплазматичні утвори, що містять внутріклітинні органоїди і характеризуються структурною цілісністю і здатністю здійснювати активний метаболізм, виконувати біосинтез і трансформацію енергії. В рослинній клітині протопласт являє собою морфологічно відособлене утворення при плазмолізі.

Плазмоліз - це відокремлення пристінкового шару цитоплазми від твердої оболонки рослинної клітини.

Способи виділення протопластів: Протопласти можна одержати, використовуючи тоненькі смужки епідермісу луски цибулини, які витримують в 0,1м розчині цукрози до тих пір, поки протопласти не стиснуться і не відійдуть від своїх клітинних стінок. Якщо потім розрізати бритвою смужки епідермісу, протопласти будуть виходити в середовище. Це - механічний метод виділення протопластів. Проте цей метод створює певні обмеження: за допомогою цього методу можна виділити невелику кількість протопластів; використовуються тільки ті тканини, в яких має місце екстенсивний плазмоліз; важко одержати протопласти із меристемної або зрілої тканини; цей метод займає багато часу і є трудомістким.

До того ж плазмоліз досить-таки руйнує структурно-функціональний комплекс клітини, а саме: розриває плазмодесми - протоплазматичні утворення, які пронизують стінки молодих клітин. Крім того, синтез компонентів клітинної стінки здійснюється за участі цитоплазматичних структур (апарат Гольджі, ендоплазматичні ретикули, мікротрубочки) та ферментних систем, пов'язаних із цитоплазмою. Всі ці взаємозв'язані процеси порушує плазмоліз до того ж відбувається часткове розкладення поверхневої мембрани протопласту.

Принципово відрізняється метод одержання ізольованих протопластів - ензиматичний, де використовують ферменти для усунення клітинної стінки. До перших робіт належать досліди, в яких протопласти із клітин гриба були ізольовані обробкою клітинних стінок шлунковим соком слимаків.

В мікробіології для руйнування клітинних стінок бактерій був застосований фермент лізоцим. Ізолювання протопластів із клітин вищих рослин за допомогою ферментних препаратів вперше було успішно проведено Е.Кокінгом.

В порівнянні з механічним методом ферментативне виділення протопластів має певні переваги: 1) одночасно можна виділити велику кількість протопластів; 2) протопласти не піддаються сильному осмотичному стисканню; 3) клітини більш інтактні і не пошкоджуються; 4) метод здійснюється порівняно швидко.

Для усунення клітинної стінки використовують ферментні препарати трьох типів - целюлози, геміцелюлози і пектинази. Дія цих ферментів спрямована на руйнування основних компонентів клітинної стінки. У рослин це - целюлоза, геміцелюлоза та пектинові речовини.

Умови одержання життєздатних протопластів. Виділення протопластів - технічно добре відпрацьована процедура і досить легко виконується. Але одержати життєздатні протопласти непросто. Це залежить від багатьох факторів: складу ферментів, їх якості, рН середовища, вибору осмотичного розчину. Велике значення має фізіологічний стан рослинного матеріалу, його вік, умови вирощування. Фактори, які активізують ріст рослини, будуть збільшувати вірогідність одержання життєздатних протопластів. Наприклад, для успішного виділення протопластів з тютюну оптимальними будуть такі умови вирощування рослин: температура 22°С, освітленість 10000-20000 лк протягом 15год. щоденне підживлення азотом.

Для одержання протопластів із суспензійних та клітинних культур найбільш сприятливою є стадія логарифмічної фази росту. В цей період стінки клітини краще піддаються ензимному розкладання, а протопласти стають життєздатними. Вихід протопластів залежить від складу середовища. Збільшення концентрації ауксину та зниження концентрацій цукрози за добу до початку ізоляції протопластів активізують їх вихід. Вважають, що ці умови впливають на склад клітинної стінки і полегшують її ензиматичний розпад.

Введення мікроорганізмів у популяції культивуючих рослинних клітин Для одержання асоціацій на основі культивуючих клітин і тканин використовують різноманітний видовий набір рослинних об'єктів та мікроорганізмів. Культури клітин, тканин можна одержувати з бобових, злаків, овочевих та інших економічно важливих рослин. З мікроорганізмів використовують в основному азотофіксуючі форми, серед яких є симбіотичні та вільно існуючі бактерії, а також ресимбіотичні ціанобактерії. Крім того, для одержання асоціацій з каллусними культурами використовують зелену водорость та різні види грибів.

Слід відмітити, що одержання азотфіксуючих асоціацій при взаємодії бульбочкових бактерій з клітинами небобових рослин приводить до висновку про принципову можливість поширення симбіозу з бульбочковими бактеріями на небобові рослини. На цій основі різні комбінації еукаріотних клітин та азотфіксуючих мікроорганізмів можуть бути використані в експериментах in vitro для з'ясування високої специфічності природних симбіозів та розуміння причин, внаслідок яких симбіоз у природі виник вибірково тільки у деяких груп рослин.

Не припиняються експерименти зі створення асоціацій рослинних клітин із зеленими водоростями, грибами.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Історія розвитку методу культури клітин вищих рослин	\|	Сфера діяльності Червоного Хреста.

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.015 сек.