Піросеквенування 3

Піросеквенування 2

Піросеквенування 1

Оптичне картування

Одно-молекулярні технології

Окремі молекули ДНК прикріплені до скла

Коли ДНК розрізають, мікроскоп записує довжину фрагментів

Наявність потенціалу для швидкої генерації карт рестрикції

На сьогоднішній день постійно розробляються технології спрямовані на підвищення ефективності та швидкості картування та секвенування. Оптичне картування було розроблено для прискорення процесу фізичного картування. У цьому методі, окремі молекули ДНК виділяють і прикріпляють до стекла. Рестрикційні ферменти, які знаходяться в розчині на слайді, потім активують. Коли ДНК розрізається ферментами рестрикції, камери, що

підключена до мікроскопу записує довжину отриманих фрагментів. Цей метод є успішним у картуванні різних геномів і має потенціал, щоб швидко генерувати карти, які засновані на рестрикційно-ферментному розщепленні.

Виробництво пірофосфатів в реакції секвенування

Кожен раз, коли полімераза додає нуклеотид (dNTP) на зростаючі ланцюги, пірофосфат (РР) вивільняється

Кількість пірофосфатів, що вивільнились дорівнює числу доданих нуклеотидів

Піросеквенування використовує включення нуклеотидів за допомогою полімерази для визначення послідовності ДНК. Однак, на відміну від послідовності Сенгера, де використовується зупинка ланцюга, піросеквенування виявляє включення кожного нуклеотида через випуск пірофосфату (PPI). Кількість звільненого PPi, пропорційно кількості доданих нуклеотидів. Таким чином, якщо нуклеотид додається, то така є кількість PPi буде відпущена. Якщо два нуклеотида буде додано, один за одним, то в два рази більше PPi буде відпущено.

Кількість випущених PPi :

ATФ сульфурілаза перетворює PPi до АТФ

АТФ використовується ферментом люціферази, щоб справити світло за допомогою люциферина

Кількість світла, що виникає прямо пропорційно кількості АТФ, яка є пропорційною до кількості випущених PPi.

Кількість випущених PPi вимірюється шляхом перетворення його в АТФ, за допомогою ферменту АТФ сульфурілази . ATФ потім використовується ферментом люціферази, щоб справити світло за допомогою люциферина. Кількість світла, що виникає в цій реакції прямо пропорційна кількості АТФ, яка, в свою чергу, прямо пропорційна сумі звільнених PPi, при додаванні нуклеотидів за допомогою полімерази.

Послідовне додавання кожного dNTP будує послідовність

Використовують фермент апірази, для денатурації dNTP після завершення реакції

Послідовність читається за допомогою кількості світла, що вимірюється так як кожен dNTP.

Послідовність визначається шляхом додавання кожного нуклеотиду, а потім визначається світло яке виробляється і скільки. Ця інформація реєструється на "пірограммі", від якої читається послідовність. Після додавання кожного нуклеотида і реакція завершається, фермент апірази додається для деградації нуклеотидів, що залишились.

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Послідовність читання флуоресцентно мічених реакцій	\|	Лекція №12 з патоморфології та патофізіології

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.