Хід роботи

Кров, отриману шляхом скарифікації шкіри (з пальця, з крайової вени вуха кролика, з кінчика хвоста у мишей і щурів тощо), набирають в еритроцитарний меланжер до позначки 0,5; потім фізіологічним розчином доводять об’єм до позначки 101. Протягом 3–5 хв добре перемішують одержану рідину збовтуванням. Видаляють перші три краплі та переносять зразок у камеру Горяєва. Через 1–2 хв після осідання еритроцитів на дно камери рахують їхню кількість під мікроскопом. Підрахунок проводять у п’яти великих квадратах, що містять по 16 маленьких квадратів, розташованих по діагоналі.

Загальну кількість еритроцитів визначають за формулою:

Х = (А × 400 × 200) ∕ 80,

де Х – загальна кількість еритроцитів у 1 мкл крові; А – підрахована загальна кількість еритроцитів у п’яти великих квадратах; 200 – коефіцієнт розведення; 80 – кількість підрахованих малих квадратів.

Нормальні значення та клініко-діагностичне значення див. п. 2.1.2.3.

2.2.1.2. Визначення глікогену еритроцитів цитохімічним методом

Принцип методу. Цито- і гістохімічні методи дослідження гемопоетичних клітин спрямовані на виявлення певних хімічних речовин (наприклад, Феруму, Кальцію, білків, ліпідів, нуклеїнових кислот, глікогену, ферментів) чи функціональних груп (наприклад, аміногруп, альдегідних, сульфгідрильних). Вони базуються на специфічному зв’язуванні барвників із певними хімічними сполуками (наприклад, ДНК і РНК) чи утворенні забарвлених продуктів у місці розташування цієї речовини (наприклад, ферменту) у результаті гістохімічної реакції. Матеріал, що використовується для вивчення гісто- і цитохімічними методами, слід фіксувати способом, що максимально зберігає речовину, яку виявляють; з цією метою бажано використовувати заморожений нефіксований матеріал. Методами цито- і гістохімії визначають розподіл і оцінюють вміст у клітинах і неклітинних компонентах тканин речовини, що належать до різних груп, − ДНК і РНК, білків, амінокислот, ліпідів, вуглеводів, мінеральних речовин, оцінюють активність ферментів.

Реакція ШЙК чи РАS – приклад одного із найбільш використовуваних гістохімічних методів. Назва методу походить від скороченої назви реактиву Шиффа – Йодна кислота (від англ. Periodic Acid Schiff). Метод використовується для виявлення вуглеводів та їхніх похідних – глікогену, глікопротеїнів, мукопротеїнів, протеогліканів і ін. Він базується на окисненні йодною кислотою гідроксильних груп цукрів до альдегідних груп, з якими зв’язується безколірний реактив Шиффа (містить фуксин), перетворюючись на стабільну сполуку червоного кольору.

Визначення глікогену еритроцитів проводять цитохімічно за методом Шабадаша.

Обладнання. Вата, скарифікатори, предметні скельця, шліфоване скло, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, кювета для забарвлення препаратів, термометр, мікроскоп, рукавички.

Реактиви

1. Рідина Шабадаша – 0,03 М розчин калій перйодату.

2. Реактив Шиффа – 1 г фуксину для фуксин сульфітної кислоти розчиняють у 200 мл киплячої дистильованої води і охолоджують до +50 ºС. Відфільтровують і додають 20 мл 1 н хлоридної кислоти, охолоджують до +2 ºС і додають 1 г натрій метадисульфанату; розчин повинен бути прозорим, злегка жовтуватим, рН 2,0.

3. Сірчиста вода – до 10 мл 10 % розчину калій метадисульфату додають 200 мл води і 10 мл 1 н НСl.

4. Гематоксилін.

5. Реактив Шабадаша – до 100 мл етилового спирту додають 1,8 г купрум нітрату, 0,9 г кальцію нітрату і 10 мл формаліну.

Хід роботи

Виготовляють мазки крові (див. п. 2.1.2.8). Висушений мазок крові фіксують у рідині Шабадаша 30 хв, промивають у двох змінах дистильованої води та інкубують. Занурюють у перйодат на 20 хв (у темряві). Промивають у сірчистій воді 1−2 хв. Промивають у трьох змінах дистильованої води, забарвлюють реактивом Шиффа 30−40 хв (у темряві). Промивають у трьох змінах дистильованої води (по 3 хв) і у трьох змінах сірчистої води, забарвлюють водним розчином гематоксиліну (5−10 хв), промивають у дистильованій воді, висушують і мікроскопують. Глікоген забарвлюється у червоно-вишневий колір.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Підрахунок кількості еритроцитів меланжерним методом	\|	Визначення осмотичної резистентності еритроцитів

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.