Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Готують цитратну кров: до 500 мкл крові додають 50 мкл 5 % розчину натрій цитрату (правильне співвідношення крові і антикоагулянту (в даному випадку натрій цитрату) 10:1. Кров з антикоагулянтом переносять у центрифужні пробірки. Якщо об’єм крові невеликий (від 0,2 до 0,5 мл), то можна проводити центрифугування в пробірках типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар (плазма) відсмоктують пастерівською піпеткою або за допомогою шприца з довгою голкою і виливають. Еритроцити тричі промивають охолодженим фізіологічним розчином (0,9 % розчин натрій хлористого) при 3 000 об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою у співвідношенні 1:2 (еритроцитарна маса : дистильована вода). Суміш перемішують протягом 10 хв і центрифугують 10 хв при 8 000 об/хв для відділення стром еритроцитів. За допомогою шприца з довгою голкою відбирають супернатант (гемолізат) і переносять в чисту пробірку Еппендорф.

Для визначення концентрації гемоглобіну з отриманого гемолізату відбирають 0,02 мл, додають 5 мл розчину Драбкіна і через 20 хв вимірюють екстинкцію розчину при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі шириною 10 мм проти контролю – розчину Драбкіна чи дистильованої води на спектрофотометрі чи фотоелектроколориметрі.

Концентрацію гемоглобіну обчислюють за формулою:

С_Нв = Е₅₄₀ × 251 × 1,45,

де С_Нв – концентрація гемоглобіну в гемолізаті, г/л, або мг/мл; 251 – розведення; 1,45 – коефіцієнт перерахунку.

Клінічне значення. Низький рівень гемоглобіну свідчить про те, що є анемія. Але для того, щоб остаточно з’ясувати, яка анемія, потрібно зробити додаткові спеціальні дослідження. Наприклад, визначити показники обміну Феруму, до яких належить рівень сироваткового Феруму та феритину. Показник гемоглобіну може знизитися й після місячних у дівчаток, внаслідок різних гінекологічних недуг, нез’ясованих крововтрат у жінок, навіть незначної або постійної кровотечі з зубів та ясен.

2.2.3.2. Визначення гемоглобіну у фіксованих препаратах

Принцип методу. Гемоглобін при взаємодії із бензидином та етилгідропіритом утворює продукт, що має жовте і зеленувато-коричневе забарвлення.

Обладнання. Вата, скарифікатори, предметні скельця, шліфоване скло, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, кювета для забарвлення препаратів, секундомір, мікроскоп, рукавички.

Реактиви

1. Метанол.

2. Етиловий спирт – 70 % і 96 % розчини.

3. Бензидин.

4. Пергідроль – 30 % розчин.

5. Інкубаційна суміш – 12 мг бензидину розчиняють у 2 мл 96 % етилового спирту, додають 5 мл спиртового розчину пергідролю (0,5 мл 30 % розчину пергідролю розчиняють у 4,5 мл 70 % етилового спирту). Інкубаційну суміш готують безпосередньо перед використанням.

6. Азур ІІ-еозин або фарба Романовського-Гімза.

Матеріал. Препарати тканинних культур, суспензія клітин, мазки-відбитки тощо.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Виготовляють мазки крові (див. п. 2.1.2.8). Висушений мазок крові фіксують 10−20 хв у метанолі, висушують, вміщують на 5−15 хв в інкубаційну суміш. Промивають у проточній воді, висушують і забарвлюють азур ІІ-еозином (20−30 хв) чи за Романовським-Гімза.

Оцінка результатів. У клітинах, що містять гемоглобін, відбувається кольорова реакція з утворенням продукту, забарвленого від жовтого до зеленувато-коричневого кольорузалежно від вмісту у них гемоглобіну, у деяких випадках можливе легке забарвлення еозинофілів. Оцінку гемоглобіновмісних елементівна мазках проводять у режимі світлової мікроскопії за збільшення ×1 200 під імерсійною олією за шкалою +++, ++, +, 0. Для визначення клітин з позитивною пероксидазною реакцією на гемоглобін підраховують кількість клітин з різною інтенсивністю реакції (+++, ++, +, 0); всього рахують 1 000 клітин на мазку. За пропорцією визначають розподіл.

2.2.3.3. Забарвлення тотальних препаратів на гемоглобін солянокислим бензидином

Принцип методу. Гемоглобінвмісні клітини крові чи культури тканин при взаємодії із бензидином у присутності пероксиду водню та натрій ацетату утворюють продукт, що має синє забарвлення.

Реактиви

1. Бензидин – 1 % спиртовий розчин солянокислого бензидину (1 г солянокислого бензидину розчиняють у 100 мл 96 % спирту).

2. Пероксид водню – 3 % розчин (готують безпосередньо перед використанням).

3. Натрій ацетат – 10 % водний розчин.

Матеріал. Препарати тканинних культур, суспензія клітин, мазки-відбитки тощо.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Виготовляють мазки крові (див. п. 2.1.2.8), висушують. До нативної нефіксованої культури тканини чи нефіксованого мазка крові додають 3−5 мл 1 % розчину солянокислого бензидину, через 30−40 с – 0,5 мл розчину пероксиду водню, потім (через 1−2 хв) ще 0,5 мл 10 % розчину натрій ацетату.

Оцінка результатів. В еритроїдних, гемоглобіновмісних колоніях, кластерах і окремих клітинах, які містять гемоглобін, відбувається кольорова реакція з утворенням продукту, забарвленого у синій колір. Оцінку гемоглобіновмісних елементів на мазках проводять у режимі світлової мікроскопії за збільшення ×1 200 під імерсійною олією за шкалою +++, ++, +, 0. Для визначення клітин з позитивною реакцією на гемоглобін підраховують кількість клітин з різною інтенсивністю реакції (+++, ++, +, 0); всього рахують 1 000 клітин на мазку. За пропорцією визначають розподіл.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Хід роботи	\|	Визначення вмісту лужностійкого гемоглобіну

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.