• Гідрологія і Гідрометрія
• Господарське право
• Економіка будівництва
• Економіка природокористування
• Економічна теорія
• Земельне право
• Історія України
• Кримінально виконавче право
• Медична радіологія
• Методи аналізу
• Міжнародне приватне право
• Міжнародний маркетинг
• Основи екології
• Предмет Політологія
• Соціальне страхування
• Технічні засоби організації дорожнього руху
• Товарознавство продовольчих товарів

Поверхневі глибинні донні

Плівка, осад

Культура мікроорганізмів

Тверде середовище Рідке середовище

Колонії

Помутніння середовища,

Рис. 4. Вигляд культур мікроорганізмів на твердих та рідких середовищах

Вивчення ознак росту найкраще проводити, коли на поживному середовищі розвиваються представники тільки одного виду (чиста культура). Сукупність ознак росту мікроба на середовищі будь-якого типу є культуральними ознаками даного виду (табл.3).

Табл..3. Ознаки колоній на твердих середовищах

Відомості про зовнішній вигляд колоній, які виросли в чашках Петрі, доповнюють характеристикою мікробного росту на поверхні скошеного твердого середовища в пробірках (ріст при висіві штрихом).Такими показниками є:

· інтенсивність росту (незначний, помірний, інтенсивний);

· основний характер росту (суцільний, у вигляді ланцюжка ізольованих колоній, дифузний, ризоїдний тощо);

· поверхня, консистенція та оптичні властивості штриха.

Чисті культури, вирощені в бульйонах, також мають певні ознаки (табл.4).

Табл.4. Розвиток мікробів на рідких середовищах.

Дослідження морфологічних ознак мікроорганізмів, вирощених в твердих або рідких середовищах, проводиться шляхом мікроскопії. В залежності від особливостей мікроба його будову можна вивчати в живих або фарбованих (мертвих) препаратах. Живі мікробні клітини прозорі і лише трохи виділяються на фоні поля зору у мікроскопі.

В живому вигляді зручно вивчати:

· морфологічні особливості таких великих за розмірами мікробних клітин як гриби та дріжджі (еукаріоти). В готових препаратах можна побачитиформу клітин, спор та ін. структур. Препарат готується методом “розчавленої краплі”;

· виявляти здатність до руху у бактерій певних видів. В таких препаратах органів руху – джгутиків – не видно. Але направлений рух мікроорганізмів в полі зору мікроскопу під час тривалого спостереження забезпечують саме ці структури. Препарат готується методом “висячої краплі” на спеціальних предметних скельцях з лункою.

Фіксовані препарати використовують для вивчення форми, розмірів клітини, будови її органоїдів та структур. Виготовлення таких препаратів пов’язане з фарбуванням і для цього використовують анілінові барвники у вигляді водних і неводних розчинів. В залежності від кількості барвників розрізняють прості і складні методи фарбування (табл.5). Прості використовуються для вивчення форми і розмірів клітини, складні – для вивчення структур клітини.

Таблиця 5. Загальна характеристика методів фарбування

Одним із найпопулярніших та найважливіших складних методів фарбування є метод Грама. Принцип методу Грама:

ü мікробну клітину зафарбовують основним аніліновим барвником фіолетового або – рідше – зеленого чи синього кольорів.

ü обробка протравою, внаслідок чого утворюється потрійний комплекс барвник+протрава+речовини клітини. Це з’єднання стійке у грампозитивних бактерій і нестійке – у грамнегативних.

ü короткочасна обробка препарату знебарвлювачем (спирт, ацетон, ксилол тощо). Потім знебарвлюючу речовину видаляють з водою.

ü препарат зафарбовують контрастним (червоним) барвником.

Крім того, при проведенні діагностики хвороби бактеріолог повинен виконати фарбування за певними методиками для виявлення кислотостійких мікроорганізмів, наявності капсул у бактерій та ендоспор у бацил.

Фарбування оболонок кислотостійких мікроорганізмів. Будова оболонок деяких мікробних клітин така, що вони погано взаємодіють з кислотами. До таких – кислотостійких – мікроорганізмів належать актиноміцети, мікобактерії та деякі бактерії, споріднені із ними, а також – бацилярні клітини з ендоспорами. Самим відомим методом для виявлення кислотостійких мікроорганізмів в патологічному матеріалі є метод фарбування Циля-Нільсена, а послідовність фарбування представлена на схемі (табл.6). Крім вищезазначеного, кислотостійкі мікроорганізми в матеріалі виявляються флуоресцентним методом (метод Труанта). Фарбуючий розчин, що використовується на першій стадії роботи, містить аурамін О та родамін В, додатковим барвником є розчин марганцевокислого калію.Дослідження препарату проводиться в люмінесцентному мікроскопі. Кислотостійкі мікроби – жовто-оранжеві на темному фоні.

Табл. 6. Фарбування за методом Циля-Нільсена

Виявлення капсул.Капсула складається з полімерів різної будови: поліцукрів, ліпополісахаридів, поліпептидів. Ці структури у бактерій можна досліджувати різними методами в живих та фіксованих препаратах:

· суспензію живих бактерій роблять не у воді, а у розчині стерильної туші (негативне фарбування).

· до водної суспензії живих мікробів додають такі барвники, як 3% конго червоний або 10% опаловий синій. Головна проблема методу – отримання одношарового препарату бактерій. Для цього надлишок рідини відсмоктують фільтрувальним папером і одночасно притискають плівку покривним скельцем, що потребує певних навичок у дослідника.

· речовини капсули дуже легко руйнуються при фіксації препарату, тому цю стадію роботи потрібно проводити обережно. Тому фіксація при дослідженні капсул здійснюється хімічним шляхом або пасивно (висушування на повітрі). Надалі препарат фарбують певними барвниками.

Докладні методики виявлення капсул у бактерій та результати досліджень у кожному випадку представлені в таблиці 7.

Табл.7. Методики виявлення капсул у бактерій.

Виявлення ендоспор. При спостереженні в живому стані спори бацил мають вигляд овальних утворень, які сильно заломлюють світло. Вони розміщені в середній частині або на кінці бактеріальної клітини. Оболонки ендоспори не дають можливості ефективно профарбувати клітину бацили одним барвником. Тому простими методами ендоспори не виявляються взагалі.

Оболонки змінюють відношення до фарбування після обробки розбавленою гарячою (60^оС) НС1. Крім того, розроблені методики фарбування, які грунтуються на комбінованій дії концентрованих розчинів барвників і температури (табл.8).

Табл.8. Методики виявлення ендоспор бацил.

Після проведення перших етапів дослідження проводиться порівняння морфологічних та культуральних ознак досліджуваного мікроорганізму із даними довідників. Це дозволяє віднести його до певного роду або, навіть, виду. Але точне встановлення видової належності збудника потребує проведення додаткових досліджень: виявлення біохімічних властивостей мікроба, проведення біологічної проби на лабораторних тваринах, постановки серологічних реакцій.

Біохімічні дослідження чистої культури збудника.Одна з обов’язкових стадій бактеріологічної діагностики, яка полягає у вивченні харчових потреб мікроорганізму.Такі дослідження проводять в декількох напрямках (табл.9) і найчастіше вивчають здатність до перетравлення:

· вуглеводів(моносахариди та їх похідні, дисахариди) – цукролітичні властивості;

· білківм’ясо-пептонного бульйону та молока, олігопептидівжелатинита окремих амінокислот(сірковмісних та триптофану) – протеолітичні властивості;

· ферментів патогенності(каталаза, ДНК-аза, коагулаза );

· окремих речовин шляхом постановки спеціальних реакцій (перетравлення жовчі, САМП- проба , реакція Фогес-Проскауера та ін.)

Таблиця 9. Методики біохімічних досліджень.

При проведенні біохімічних досліджень для виявлення цукролітичних та протеолітичних властивостей мікробів користуються пробірками. Для цього в напіврідкі середовища в пробірках виконують висіви уколом (бактеріологічна голка), висіви в бульйон роблять піпетками або петлями. При висіві уколоммікробний матеріал з колонії беруть бактеріологічною голкою, прожареною та охолодженою в агарі. Висів виконують уколом голки в глибину поживного середовища по центру пробірки. Пробірку з напіврідким живильним середовищем тримають майже горизонтально, а пробірку з желатиною – вертикально вверх дном. Завдяки цьому середовище не забруднюється мікроорганізмами з повітря.

Для виявлення протеолітичних властивостей мікроорганізми чистої культури висівають в бульйон, желатину та молоко. Для цього прожареною та охолодженою в агарі бактеріологічною петлею беруть мікробний матеріал. Вносять його в пробірку з рідким середовищем, легко струшують у верхньому меніску рідини. Петлю виймають та фламбірують, пробірку закривають і поміщають у термостат.

Виявлення ферментів патогенності або здатність мікробів до здійснення спеціальних реакцій виконують за певними методиками. Користуються предметними скельцями, пробірками, чашками Петрі, бактеріологічними петлями та голками, піпетками.

Біологічна проба. Даний вид досліджень проводять для виявлення патогенностівиділеного мікроорганізму. Використовують здорових лабораторних тварин різних видів (білі миші, щури, морські свинки, кошенята, кролі, птахи),яких підбирають в залежності від біологічних особливостей збудника та результатів лабораторної практики, наведених в інструкціях та настановах.

Матеріал вводять шляхом ін’єкційних, шкірних та кон’юктивальних проб. Перші із зазначених швидко виявляють результат, тому є найпопулярнішими. Внутрішньочеревні, внутрішньом’язеві, інтрацеребральні та інші ін’єкційні проби ставлять із бульйонної культури з певною концентрацію клітин збудника. Чистота таких культур визначається за допомогою мікроскопії, а доза збудника – при використанні стандартів мутності.Для постановки шкірних та кон’юктивальних проб використовують матеріал агарової культури.

В результаті біопроби тварини швидко гинуть або в них виявляються ознаки хвороб (1-2 доби). Тому через певний термін часу у тварин (у вогнищі запалення)відбирають прижиттєвий або посмертний патологічний матеріал, який досліджують за допомогою мікроскопічних або серологічних досліджень.

Серологічні реакції.Такі реакції спостерігаються при використанні відповідних методик, коли антиген та антитіло взаємодіють in vitro з подальшим проявом наслідків взаємодії. За механізмом та результатами процесу взаємодії антигену з антитілом серологічні реакції поділяють на декілька типів:

· Осадові (аглютинації, преципітації);

· Лізису (реакція зв’язування комплементу);

· Нейтралізації (нейтралізація мікробних токсинів);

· Імунофлуоресценції.

Вибір тої чи іншої реакції визначається біологічними особливостями збудника хвороби, наявністю реактивів та необхідного обладнання у конкретній лабораторії.

Таким чином, перед початком діагностики завжди проводиться підготовка робочого місця (дезинфекція, ультрафіолетове опромінення), приготування необхідних поживних середовищ, барвників та інших реактивів, стерилізація середовищ та обладнання. Все це використовується для:

· проведення обробки пат матеріалу;

· мікроскопії обробленого чи необробленого пат матеріалу;

· висіву матеріалу на агарові поживні середовища з подальшою реєстрацією культуральних ознак мікробів в накопичувальній культурі та мікроскопією „підозрілих” колоній;

· виділення чистої агарової та бульйонної культури збудника;

· виявлення біохімічних, біологічних та антигенних властивостей збудника.

Послідовність виконання стадій роботи під час ідентифікації мікроорганізмів іноді змінюється. В результаті таких змін тривалість дослідження зменшується або збільшується. Причини змін в стандартній процедурі дослідження викликані біологічними особливостями досліджуваного збудника.

· збудник має характерні морфологічні та культуральні ознаки, які дозволяють ідентифікувати його на перших стадіях роботи (актиномікоз, дерматомікози);

· основна причина патологічного стану – це специфічні продукти життєдіяльності мікроба, а саме – токсини. Тоді схема направлена на виявлення цих речовин в матеріалі, а виділення чистої культури мікроорганізму має допоміжний характер (ботулізм, етеротоксемія, мікотоксикози);

· вирощування збудника хвороби внаслідок його біологічних особливостей потребує використання специфічних об’єктів для культивування, а саме – живих клітин (хламідіози, риккетсіози);

· збудник з патологічного матеріалу дуже повільно росте на штучних живильних середовищах. Після першого висіву, навіть на елективні середовища, колонії з’являються тільки через 1-2 місяці В такому випадку виділення чистої культури проводять через організм лабораторних тварин (туляремія, лептоспіроз);

· збудник хвороби має такі фізіологічні особливості, які дозволяють обробити патологічний матеріал і отримати одразу або чисту культуру збудника, або культуру з мінімальною кількістю сторонніх мікробів:

· нагрівання зразка при температурі 80-90^оС при сибірці чи клостридіозах;

· витримування зразка в холодильнику при підозрі на лістеріоз;

· обробка сірчаною кислотою або екстракція бензином при наявності в патологічному матеріалі мікобактерій;

· обробка антибіотиками, до яких збудник має стійкість, а супутня мікрофлора – ні (мікоплазмози);

· мікроорганізм спричинює небезпечну хворобу, яка є зоонозом або зооантропонозом, здатна швидко поширюватись, охоплюючи значні території. В такому випадку використовують спеціальні експрес-методики, які дозволяють пришвидшити діагностику (полімеразна ланцюгова реакція, імуноферментний аналіз, реакція імунофлюоресценції, фаготипірування і т.п.)

В більшості випадків зміни послідовності діагностики направлені на те, щоб зменшити термін дослідження і якнайшвидше видати акт експертизи (2-3 доби замість стандартних 7 діб для мікроорганізмів із високою швидкістю росту, 10-15 діб замість 2-3 місяців для мікроорганізмів, що розмножуються повільно).

Читайте також:

1. Антропогенний вплив на поверхневі та підземні води
2. Водні ресурси світу. Світовий океан, поверхневі та підземні води - реферат українською
3. Глибинні насуви
4. Глибинні розломи
5. Глибинні розломи
6. Донні відкладення в океанах і морях
7. Донні відклади і мінеральні ресурси
8. Донні відклади і мінеральні ресурси
9. Закордонні та вітчизняні моделі управління: реалізація потреб як рушій активності персоналу. Розробка програм стимулювання праці
10. Поверхневі м’язи – похідні зябрових дуг
11. Поверхневі структури клітинної стінки бактерій.

Переглядів: 904