Правила проведення фотометрії та розрахунок результатів досліджень

Рис. 3. Класифікація фотометричних методів аналізу

Абсорбційна фотометрія – метод аналізу, який заснований на вимірі ступеня послаблення монохроматичного світлового потоку внаслідок вибіркового поглинання світла розчиненою речовиною. Теоретичним обґрунтуванням фотометрії є закон Бугера-Ламберта-Бера: ,дета – відповідно вхідний та вихідний світлові потоки, e – коефіцієнт поглинання (залежить від природи речовини і температури), – товщина шару розчину, C – концентрація речовини.

– оптична густинарозчину або екстинкція.

Залежність екстинкціївід концентрації відповідно до закону лінійна і проходить через початок координат. Нахил прямої буде залежати від молярного коефіцієнту поглинання, де .

До методів абсорбційної фотометрії належать: спектрофотометрія та нефелометрія. При спектрофотометрії порівнюють інтенсивність забарвлення еталонного розчину та розчину, що аналізується. Виконують колориметрування за допомогою фото-електроколориметрів (ФЕК) і спектрофотометрів. Нефелометрія– метод аналізу, який пов'язаний з оцінкою ступеня помутніння досліджуваного розчину. При власне нефелометрії джерело і приймач світла у фотометрі розташовані взаємно перпендикулярно. Таким чином, вимірюється розсіяне світло. При турбідиметріїджерело і приймач світла знаходяться на одній осі, тому вимірюється послаблення світлового потоку, що пройшов крізь мутний (колоїдний) розчин.

Емісійна фотометрія базується на вимірі енергії, що випромінюється речовиною внаслідок енергетично збудженого стану. До методів емісійної фотометрії відносять флюориметрію, яка заснована на ефекті енергетичного збудження молекул і атомів досліджуваної речовини, як наслідок впливу жорсткого ультрафіолетового випромінювання, і полум'яну фотометрію,яка заснована на ефекті енергетичного збудження полум'ям структурних складових досліджуваної речовини. Звичайно для флюорометричних вимірів застосовують концентрації речовин 10^–4 – 10^–6 г/мл (залежність інтенсивності від концентрації прямолінійна). Якщо в якості розчину порівняння застосовується стандартний розчин речовини (спосіб порівняння або калібрувального графіку), то концентрацію досліджуваного розчину (С_х) розраховують за формулою: ,

де – показання флуорометру для досліджуваного розчину; – показання флуорометру для стандартного розчину; – показання флуорометру для контрольного розчину; – концентрація стандартного розчину.

В роботі з фотометричною апаратурою слід дотримуватись умов вимірювання, що рекомендуються методикою виконання досліджень. Таких умов, як правило, три: товщина робочого шару кювети, довжина світлової хвилі і спосіб розрахунку результатів аналізу. Для вимірювання за допомогою фотоколориметрії застосовують оптичні кювети з товщиною робочого шару 5 мм або 10 мм, рідше 3 мм.

Довжина світлової хвилі, яка зазначається в методиках, визначається фізико-хімічними властивостями розчинів. Візуальними проявами таких властивостей може бути прозорість і забарвлення розчинів.

Якщо в методиці не вказані товщина робочого шару кювети і довжина світлової хвилі, то можливо підібрати їх самостійно. Для вибору довжини світлової хвилі проводять вимірювання на всіх довжинах хвиль, що можливо встановити у приладі. Зупиняються на тій довжині, що дає найбільшу екстинкцію. Чим вище значення екстинкції, тим менше буде ціна однієї позначки шкали екстинкції та величина можливих випадкових помилок в самому процесі вимірювання. Існують наступні способи розрахунків результатів досліджень в клінічній біохімії: 1) використання умовних одиниць; 2) розрахунки за стандартними (еталонними) розчинами; 3) розрахунки за калібрувальним графіком; 4) розрахунки за коефіцієнтом перерахунку (за фактором).

Умовні одиниці (у.о.) – це примітивний варіант визначення результатів аналізу. Найчастіше це безпосередньо одиниці екстинкції розчинів. В деяких лабораторних методиках екстинкцію, одержану при вимірюванні, множать на 100, 1000 або інший коефіцієнт. Після перетворення отримують показники, які більш зручні для роботи або для порівняння. Використовують умовні одиниці в методиках, що найдавніше використовують у лабораторіях, наприклад, для визначення сіромукоїдів, сіалових кислот, ліпопротеїдів.

Розрахунки результатів досліджень за стандартними (еталонними) розчинами.Стандартні розчини обробляють паралельно з серією досліджуваного біологічного матеріалу в тих же умовах, що й досліджуваний матеріал. Їх використовують в тих випадках, коли мова йде про складні методики, що дають значні похибки. Стандартні розчини нівелюють всі можливі відхилення, але недоліком їх використання є підвищений розхід реактивів і робочого часу, що пов'язано з необхідністю регулярної постановки стандартних проб.

Стандартні розчини мають строго визначену концентрацію певної речовини. Готують їх з реактивів кваліфікації чистоти "х.ч." Зазвичай в біохімічних наборах разом з реактивами знаходиться і стандартний розчин речовини, що визначають. Наприклад, стандартні розчини є в наборах для визначення глюкози, сечовини, холестерину. Концентрація речовини в стандартному розчині повинна бути близька до фізіологічно нормальних значень відповідного компоненту в біологічних рідинах. Наприклад, концентрація стандартного розчину холестерину 5,2 ммоль/л, що знаходиться в межах фізіологічної норми холестерину в крові.

Розрахунок результатів досліджень, що виконується за стандартними розчинами, проводять за простою арифметичною пропорцією:

Е_ст – С_ст

Е_д– С_д С_д = С_ст· Е_д/Е_ст,

де Е_ст – екстинкція стандартного розчину, Е_д – екстинкція діагностичної проби, С_ст – концентрація стандартного розчину, С_д – концентрація діагностичної проби.

Розрахунки результатів досліджень за калібрувальним графікомє зручним варіантом розрахунків, що не потребує зайвих витрат робочого часу та реактивів, як при постановці стандартних проб. Використання калібрувальних графіків доцільно тільки в методиках зі стабільними умовами проведення та добрим підпорядкуванням результатів вимірювання основному закону фотометрії. Калібрувальні графіки будують для кожного фотометру окремо і неприпустимим є їх використання для іншого приладу, навіть у випадку використання однотипних приладів. Періодично, звичайно не рідше одного разу на рік, калібрувальні графіки слід перевіряти, а при необхідності – будувати заново.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Оптичні методи аналізу	\|	Лекція № 3. Обмін речовин. Обмін білків

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.004 сек.