• Гідрологія і Гідрометрія
• Господарське право
• Економіка будівництва
• Економіка природокористування
• Економічна теорія
• Земельне право
• Історія України
• Кримінально виконавче право
• Медична радіологія
• Методи аналізу
• Міжнародне приватне право
• Міжнародний маркетинг
• Основи екології
• Предмет Політологія
• Соціальне страхування
• Технічні засоби організації дорожнього руху
• Товарознавство продовольчих товарів

Загальні відомості

Загальна кількість лімфоцитів в крові є показником вмісту в організмі імунокомпетентних клітин. Загальна кількість лімфоцитів підраховується на базі лейкоцитарної формули крові (див. Лабораторну роботу №2).

При дуже схожій морфології за походженням і функціональною спрямованістю лімфоцити діляться на дві популяції, які відносяться до Т- чи В-залежної системи.

У крові людини на долю Т-клітин припадає близько 75 % лімфоцитів. В-лімфоцити складають 15%. Інші лімфоцити – це нульові клітини, вони не мають маркерів, характерних для Т- і В-клітин.

Дві основні групи Т- і В-лімфоцитів морфологічно мало відрізняються одна від одної. Основою для визначення популяцій лімфоцитів є знаходження на їхній поверхні специфічних кластерів диференціації CD маркерів за допомогою комплементарних їм молекул чи часточок.

Основні функціональні відмінності цих субпопуляцій лімфоїдних клітин полягають в тому, що В-клітини здійснюють гуморальну імунну відповідь, а Т-лімфоцити – клітинну, а також беруть участь в регуляції обох форм імунної відповіді.

Т-лімфоцити – неоднорідна за своїми функціональними властивостями група лімфоїдних клітин. Розрізнять декілька субпопуляцій Т-лімфоцитів: Т-хелпери, цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери) і Т-клітини пам’яті.

На поверхні всіх Т-лімфоцитів перебуває низка специфічних молекул: рецептори до еритроцитів барана, Т-клітинні антиген розпізнавальні рецептори (ТАГРР), молекули СD3, які є складовою частиною ТАГРР, рецептори до міогенів, рецептори до цитокінів (ІЛ-1β, ІЛ-2 тощо), антигени HLA класу І. На субпопуляції Т-хелперів додатково експресується молекула СD4, а на цитотоксичних Т-лімфоцитах – СD8. Існують й інші рецептори Т-лімфоцитів. Нижче наведена коротка характеристика основних поверхневих молекул Т-клітин:

1) ТАГРР за структурою подібний до молекули імуноглобуліну, але не тотожний йому. він побудований з константної ділянки, за рахунок якої утримується на мембрані клітини, і двох варіабельних ділянок, що безпосередньо беруть участь у розпізнанні імуногенного пептиду. Рецептор антигенного розпізнавання Т-лімфоцитів працює у комплексі з так званою СD3-структурою, що складається з 6 білків, які передають активаційний сигнал всередину клітини при збудженні рецептору антигенного розпізнавання. Отже, сигнал, переданий СD-3 комплексом, запускає активаційні імунобіохімічні процеси в цитоплазмі Т-клітини. відсутність таких молекул призводить до розвитку тяжкого імунодефіцитного захворювання.

2) СD2 – це поверхневий антиген, який виявлений на всіх зрілих периферійних Т-лімфоцитах. за природою СD2 є адгезивною молекулою. СD2-рецептор приймає участь у процесі активації Т-лімфоцитів, що важливо для проліферації клітин у тимусі.

3) СD3 – це комплекс молекул, який є сигнальною частиною антигенрозпізнавального рецептору Т-лімфоцита.

4) Рецептор до мітогенів – при взаємодії деяких лектинів рослинного походження (фітогемаглютиніну ФГА і конканаваліну А Кон-А) виникає активація, трансформація та проліферація Т-лімфоцитів у культурі in vitro. Ця властивість використовується для оцінки проліферативної активності Т-лімфоцитів (реакції бласттрансформації РБТЛ).

5) СD4 – це молекула, яка перебуває на субпопуляції Т-хелперів, і є необхідною для взаємодії антиген розпізнавального рецептору з молекулою HLA ІІ класу.

6) СD8 – поверхневий маркер, який експресується на мембранах цитотоксичних Т-лімфоцитів.

Цитотоксичні Т-лімфоцити (Т-кілери) – одна з основних клітин клітинно-опосередкованого імунітету, яка, разом з іншими клітинами, здатна здійснювати лізис мішеней. Маркерами Т-кілерів служать поверхневі антигени СD 56 і СD 16. Крім того, вони мають антиген СD 2, властивий більшості клітин лімфоїдного ряду. Т-кілери приймають участь в реалізації трансплантаційного імунітету, в розвитку аутоіммунних захворювань і в протипухлинному захисту.

Т-хелпери – складають 55 – 60% від числа циркулюючих Т-лімфоцитів. Вони несуть на своїй поверхні антиген СD4, а також рецептор до Fс-фрагмента IgМ. Т-хелпери включають В-лімфоцити в проліферацію і диференціювання, що забезпечує накопичення відповідного клону плазматичних клітин, що інтенсивно синтезують антитіла проти імунізуючого антигену. Функціональна активність Т-хелперів опосередкована гуморальними хелперними чинниками, які синтезуються цими лімфоцитами у відповідь на антигенний стимул.

Т-хелпери, стимулюючі інші Т-лімфоцити до вироблення хелперних сигналів, називають Т-підсилювачами – ампліфайєрами (від англ. to amplifier – посилювати). Недостатність хелперной функції Т-лімфоцитів призводить до відсутності відповіді організму на антигенну стимуляцію і, зрештою, сприяє персистенції в організмі людини великої кількості мікроорганізмів, розвитку злоякісних новоутворень і може бути причиною летального наслідку (смерті).

Т-клітини пам’яті після стимуляції антигеном здатні зберігати інформацію про нього до 10 – 15 років і передавати її іншим клітинам. Завдяки наявності в організмі Т-клітин пам’яті забезпечується прискорена імунна відповідь за вторинним типом при повторному попаданні даного антигену в організм.

В-лімфоцити – друга основна популяція лімфоцитів. В-клітини, перетворюючись при активації в плазматичні клітини, забезпечують продукцію антитіл. Рецепторами В-лімфоцитів для розпізнавання антигенів є молекули імуноглобулінів. На поверхні однієї В-клітини знаходиться 200 – 500 тис. імуноглобулінових молекул однакової специфічності. Ті, що відокремилися від В-лімфоцита іммуноглобулінові рецептори циркулюють в організмі як вільні антитіла.

Контакт з антигеном може служити стимулом для проліферації і диференціювання В-лімфоцита з подальшим формуванням клону однорідних клітин-нащадків, кінцевою стадією розвитку яких є плазматичні клітини, оптимально адаптовані до продукції великих кількостей антитіл.

Залежно від здатності клітин синтезувати антитіла в присутності або у відсутності стимулюючого сигналу Т-лімфоцитів серед популяції В-лімфоцитів виділяють два субкласи (В1- і В2-лімфоцити).

Дослідження лімфоцитів. Дослідження лімфоцитів включає етап виділення фракції мононуклеарів з периферійної крові. З цією метою використовують метод градієнтного центрифугування. Кров поміщають у розчин гепарину, розводять втричі забуференим ізотонічним розчином натрію хлориду та обережно нашаровують на розчин фіколу (для підвищення густини у розчин фіколу додають рентгенконтрастний препарат для внутрішньовенного введення – наприклад, верографін). В результаті між плазмою та розчином фіколу утворюється градієнт густини. Після центрифугування еритроцити та гранулоцити проходять крізь фікол та осідають на дно, а мононуклеари (моноцити та лімфоцити) залишаються у вигляді кільця в інтерфазі. Клітини збирають піпеткою, відмивають, переносять у культуральне середовище і досліджують зо допомогою різних методів.

Розділення клітин в градієнті густини.Принцип розділення клітин крові в градієнті густини заснований на відмінностях у величині їх плавучої густини. При центрифугуванні в градієнтному розчині клітини крові переміщуються в пробірці до тих пір, поки не досягнуть області градієнта, де їх плавуча густина дорівнює густині середовища.

Густина градієнта для фракціонування формених елементів крові людини і тварин різна. Для розділення лімфоїдних клітин людини використовують градієнт густини, рівний 1,077 г/см, а лімфоцитів миші – 1,119 г/см. При цьому плавуча густина мононуклеарів і лімфоцитів менша, ніж така величина використовуваного градієнта, тому ці клітини розташовуються над градієнтом. Гранулоцити і еритроцити, що мають велику плавучу густину, в процесі седиментації проходять через градієнтний розчин і опускаються на дно пробірки.

В якості градієнта густини для розділення клітин крові можна використати суміш фіколу з рентгеноконтрастними речовинами з високою щільністю (урографін, верографін, уротраст або ізопак).

Фікол – це фірмова назва синтетичного високомолекулярного сополімера сахарози і епіхлоргідрину. У імунологічних дослідженнях використовують 6,1% або 9% розчини фіколу з молекулярною масою 400 кДа (Фікол 400). Для отримання градієнтних розчинів з необхідною густиною змішують розчин фікола з 76% розчином урографіна (верографіна) в певному співвідношенні. За допомогою ареометра обережно доводять густину урографіна розчином фікола 400 до необхідної величини. Отриману суміш фікола з урографіном стерилізують в автоклаві при 0,11 МПа упродовж 30 хв або за допомогою фільтрації на бактеріальних фільтрах.

Слід зазначити, що при застосуванні методу седиментації в градієнті густини для виділення лімфоцитів із загальної суспензії формених елементів крові необхідно використати кров, звільнену від фібрину.

Отримання дефібринованої крові. Виділення лімфоцитів з крові донорів проводять за допомогою метода седиментації в градієнті щільності фіколл-урографіну. У центрифужну пробірку на 5 мл розчину фікол-верографіну (ρ = 1,077 г/мл) нашаровують 3 мл розведеної крові (попередньо цільну гепаринізовану кров розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1:3 кров:фізрозчин). Центрифугування здійснюють при 1500 об/хв. У результаті центрифугування кров розділяється на 4 окремі фракції: перша фракція на дні пробірки містить еритроцити і уламки клітин крові. Друга фракція – це розчин фікол-урографіну. Третя фракція, розташована над градієнтом, являє собою суспензію лімфоїдних клітин. Четверта фракція утворена плазмою з тромбоцитами (Рис. 3.1). Шар лімфоцитів (лімфатичне кільце) обережно збирають по всій площі перерізу пробірки, переносять в чисту, суху центрифужну пробірку і розбавляють розчином Хенкса (розчином 199) в співвідношенні 1:4. Вміст пробірки центрифугують 5 хв. Потім надосадову рідину видаляють, а отриманий осад ресуспендирують в розчині Хенкса.

а б

Рис. 3.1. Схема розділення форменних елементів крові на градієнті щільності фікол-верографіну. Позначення: а – до центрифугування кровіі, б – після центрифугування крові, 1 – градієнт щільності фікол-верографіну, 2 – кров,

3 – еритроцити, 4 – лімфоцити, 5 – плазма крові

Методи лабораторних досліджень лімфоцитів. Всі методи дослідження лімфоцитів можна поділити на дві групи:

1. Вивчення поверхневих маркерів;

2. Функціональні тести.

У 1983 році Перша міжнародна нарада з антигенів диференціювання лімфоцитів ввела в практику клінічної імунології термін «Clusters of differetiation» (кластери диференціації, скорочено CD), а у 1989 році четверта нарада прийняла першу робочу номенклатуру CD.

На сьогодні для ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів та низки інших клітин використовують три групи методів:

а) методи імунофлюоресценсії;

б) імуноферментні методи;

в) розеткоутворення.

Методи розеткоутворення.Використовуються в імунології з початку 70-х років. Ці методи дозволили імунологам розділяти і визначати Т- і В-лімфоцити периферійної крові, коли були відсутні необхідні антитіла для виявлення цих клітин. Методи розеткоутворення є найдешевшими серед методів кількісного визначення субпопуляції лімфоцитів. Методи розеткоутворення засновані на феномені прилипання до поверхні клітин корпускулярних часток, що призводить до фіксації останніх на поверхні імунокомпетентних клітин (ІКК) і утворенню добре видимих у світловий мікроскоп комплексів лімфоцит-еритроцити, що іменуються розетками (Рис 3.2). Ці реакції дістали назву реакцій розеткоутворення.

Найбільш простими є методи розуткоутворення з еритроцитами тварин. Кількість Т-лімфоцитів можна визначити за допомогою тесту розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РУЛ), оскільки доведено, що CD2 рецептори Т-лімфоцитів ідентичні Е-рецепторам і мають спорідненість до глікопротеїнів мембрани еритроцитів барана. В-лімфоцити мають рецептор до компоненту С3 комплементу. Тому використовують метод комплементарного розеткоутворення з еритроцитами бика (чи часточками зимозану), нагружених С3 компонентом комплементу. Також для визначення В-лімфоцитів використовують еритроцити барана «нагружені» антитілами (IgM) в середовищі комплементу.

ЕАС-комплекс – суміш еритроцитів барана, анти-сироватки, що містить антитіла до еритроцитів барана (отримали шляхом імунізації кролика еритроцитами барана), свіжої сироватки мишей, що містить комплемент.

Для постановки реакції суспензію лімфоцитів інкубують з суспензією еритроцитів тварин. Після цього підраховують кількість клітин, які утворили розетки. Розеткою називають клітину, до якої прикріплені не менше, ніж три еритроцити. При підрахунку знаходять 100 або 200 лімфоцитів і вираховують відсоток розеток серед них. Знаючи загальну кількість лімфоцитів, можна кількісно підрахувати чисельність популяції.

Рис.3.2. Схема комплексу лімфоцит (1) – еритроцити барана (2)

Пізніше було встановлено, що кількість недоліків у реакціях розеткоутворення досить велика. Отримані результати залежать від умов постановки експерименту, від якості реактивів, визначаються не лише експресією маркерних молекул, але і станом цитоскелету клітин та ін.

Нині, у зв'язку з появою технології отримання моноклональних антитіл до маркерних молекул імуноцитів, метод розеткоутворення втратив своє значення і практично не застосовується в клінічній імунології для визначення кількісного складу Т- і В-субпопуляцій в периферичній крові.

У експериментальній імунології його використовують для отримання інформації про зміну функціональної активності лімфоїдних клітин під впливом зовнішніх фізичних (УФ-радіація) або хімічних (лікарські препарати, цитокіни і їх індуктори) факторів.

Завдання на виконання:

1. Самостійно виділити лімфоцити з периферійної крові в градієнті густин фікол-верографіну (центрифугування, 1500 об/хв, 15 – 20 хв):

1.1. В чисту пробірку №1 наливають 1 мл гепаринізованої крові і додають 3 мл фізіологічного розчину.

1.2. В пробірку №2 наливають 5 мл розчину фікол-верографіну (ρ = 1,077 г/мл). Обережно, по внутрішній стороні пробірки пастеркою з грушею додають 2,5 – 3 мл розведеної крові з пробірки №1.

1.3. Кров центрифугують упродовж 20 хв за кімнатної температури при 1500 об/хв.

1.4. Після центрифугування в пробірці спостерігають чотири фракції (Рис.3.1): І – уламки клітин і еритроцити; ІІ – градієнт густини фікол-верографіну; ІІІ – лімфоцити; ІV – плазма крові.

2. Обережно підвести кінчик пастерки до шару лімфоїдних клітин і за допомогою гумової груші відібрати ці клітини і перенести їх в стерильну пробірку.

3. Клітини відмити в середовищі 199 за допомогою центрифугування (центрифугування 1500 об/хв, 5 – 7 хв).

4. Після центрифугування надосадову рідину злити, до осаду додати 0,5 – 1 мл середовища 199, осад ресуспендувати.

5. Одержану суміш лімфоцитів розділити на кілька проб у різні пробірки, додати Т-систему (проба №3) та В-систему (проба №4).

6. Проби №3 з Т-лімфоцитами (Т-системою) струшують та ставлять на 30 хв у термостат за 37°С, потім на 1 год у холодильник за температури 6 – 8°С. Виймають з холодильника, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.

7. Проби №4 з В-лімфоцитами (В-системою) струшують та ставлять на 15 хв у термостат за 37°С. Виймають з термостата, легенько струшують і виливають на предметне скло. Мазок підсушують і залишають до наступного заняття.

8. Провести фарбування мазків крові (Лаб. роб. №2):

Спосіб №1. На мазок крові наносять фарбу-фіксатор Мая-Грюнвальда на 3 хв; фарбу змивають дистильованою водою; потім на мазок наносять розведену фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2) на 20 хв; мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

Спосіб №2. На мазок крові наносять етиловий спирт на 20 – 25 хв до випаровування фіксатора; зафіксовані мазки забарвлюють упродовж 20 хв фарбу Романовського-Гімзе (розведення 1:2); мазок змивають дист. водою до стікання чистої води; підсушують на повітрі.

9. Підрахувати формені елементи крові у мазках за допомогою світлового мікроскопу (´90) з імерсією: визначити відсоток лімфоцитів, моноцитів, нейтрофілів, еозинофілів та базофілів (закінчення Лаб. роботи №2).

10. Порівняти одержані значення кількості клітин зі значення нормальних показників крові здорової людини або тварин.

10.1. Показники складу крові щурів:

Таблиця 3.1.

Читайте також:

1. I. Загальні збори АТ
2. I. ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
3. I. Загальні положення
4. II. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ.
5. IX. Відомості про військовий облік
6. IX. Відомості про військовий облік
7. V Практично всі психічні процеси роблять свій внесок в специфіку організації свідомості та самосвідомості.
8. XXXIII. ЗАГАЛЬНІ ПРОФЕСІЇ (У ВСІХ ГАЛУЗЯХ ГОСПОДАРСТВА)
9. А) загальні критерії
10. Білковий обмін: загальні відомості
11. Біографічні відомості
12. Боротьба з проявами національної самосвідомості

Переглядів: 1584