Культура еукаріотичних клітин

Тема: Клітинна інженерія

1. Культура еукаріотичних клітин

2. Біотехнологія і гібридизація соматичних клітин

3. Біотехнологія трансплантації ядер

4. Вивчення нових і поліпшених існуючих сортів рослин і штамів мікроорганізмів

ЛІТЕРАТУРА:

1.В.О. Слободян Основи біотехнології. Навчальний посібник. – Івано-Франківськ: ІМЕ «Галицька академія»,2006-200с.

2.В.Г. Герасименко Біотехнологія. Підручник / В.Г. Герасименко. – К.: Фірма «ІНКОС», 2006. – 647с.

3.В. Вакула Биотехнология: что это такое? – Москва «Молодая гвардия» 1989. – 264с.

Досягнуті молекулярною біологією і генетичною інженерією успіхи останнім часом значною мірою стали можливими завдяки застосуванню порівняно простих (а тому доступних широкому колу експериментаторів), відтворених і результативних методів, де як об'єкти дослідження широко використовуються бактерії, нижчі гриби і бактеріофаги. При цьому мікробні клітини і фаги розмножуються in vitro на агаровому середовищі, утворюючи відповідно колонії і бляшки, які являють собою потомство однієї особи (мікробної клітини чи вірусної частки). Розробка методів, що дозволяють одержувати і надалі підтримувати культури клітин еукаріотичних багатоклітинних організмів, у яких одноклітинний організм цілком зберігає геном вихідного виду й одночасно в багатьох відносинах поводить себе як мікроорганізм, є свого роду фундаментом, на якому зводиться будова клітинної інженерії і біотехнології.

Однією з основних властивостей клітинних культур є обмежена тривалість життя навіть за умови постійного перенесення їх на свіже поживне середовище (після 50-100 поділів клітинні культури гинуть). Не є винятком і такі клітини, які добре переносять культивування — фібробласти. Чим менше вік джерела, з якого отримані клітини для культивування в культурі, тим більше разів вони здатні ділитися перш ніж загинути. Так, якщо донором є плід, то кількість поділів клітин, що знаходяться у культурі, досягає 50; однак тільки до 30 разів діляться клітини, взяті для культивування у немовляти.

Для пояснення старіння і загибелі клітин запропоновано кілька гіпотез, одна з яких пов'язує старіння з нагромадженням соматичних мутацій, порушенням транскрипції і трансляції, біосинтезом значної кількості неактивних чи частково активних молекул, що призводить до збільшення кількості аномальних продуктів обміну.

Гіпотеза запрограмованої загибелі клітин передбачає, що смерть клітин — це результат реалізації генетичної програми. Наявні експериментальні дані підтверджують, що загибель клітин у культурі й організмі настає після кількості поділів, які збігаються, і є наслідком реалізації генетичної програми. Висловлюється думка, що однією з причин загибелі клітин, у яких порушене співвідношення між швидкістю поділу й інтенсивністю обміну, є нагромадження ліпофусцину, що утворюється внаслідок розпаду білкових структур, ліпідів і гему. У клітинах, що діляться, накопичується ліпофусцин, який розподіляється між дочірніми клітинами. Крім цього, речовини, що входять до складу ліпофусцинових гранул, використовуються повторно (Зенгбуш П., 1984). Процесу нагромадження ліпофусцину в загибелі клітин відведена важлива роль, але нема пояснення, чому настільки тривале життя в культурі ракових клітин. Анеуплоїдні (клітини, у яких число хромосом у ядрах не є кратним гаплоїдному набору), а також багато ліній пухлинних клітин є винятком з цього правила.

З 1951 р. культивується лінія анеуплоїдних (60-70 хромосом) пухлинних клітин, відомих як клітини НеLа. Вони були отримані з пухлинної тканини померлої від раку матки негритянки. На сьогодні ця культура клітин в умовах лабораторій за показниками росту перевершує інші лінії, отримані згодом від хворих на рак людей білої раси. Фермент глюкозо-6-фосфатде-гідрогеназа негрів і людей з білою шкірою при гельелектрофорезі поводиться неоднаково, що покладено в основу маркірування клітин НеLа. Що стосується рослинних клітин, то наявні дані до розмноження черешками свідчать про необмежену здатність клітин рослин до поділу.

Для підтримки функціонально активного стану клітин у культурі важливою була розробка відтворених умов культивування, особливо необхідність стандартизації складу поживного середовища. Так, у середовище для культивування фібробластів миші вводили кінську сироватку, екстракт із курячих ембріонів і солі. Відомі модифікації цього поживного середовища, а також приписи середовищ, пропоновані іншими авторами. Якщо вимоги до складу поживного середовища з боку клітин не дуже суворі, то допустимі коливання реакції середовища невеликі (оптимум рН знаходиться у межах 7,2-7,4); зменшення чи збільшення рН на 0,2-0,4 супроводжується загибеллю клітин у культурі. При тривалому культивуванні зростають вимоги до буферних розчинів. Перевага надається гліцилгліциновому, трис-(гідроксиметил)-амінометановому і 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазинетансульфокислотному (ГЕПЕС) буферам. Вплив сироваткового компонента середовища Ігла на функціональний стан клітин у культурі тим ефективніший, чим менше вік тварини, від якої ця сироватка отримана (краще використовувати сироватку ембріонів).

Для забезпечення стерильності, що є наджорстко контрольованою умовою, останнім часом практикується використання стерильного пластмасового посуду (флаконів, чашок, піпеток) одноразового використання. У зв'язку з тим, що поділ деяких типів клітин у культурі настає лише тоді, коли вони прикріплені до субстрату, матеріал варто піддавати спеціальній обробці при підготовці до процедури культивування.

Зростаючі в культурі і прикріплені до субстрату клітини найчастіше сплющені і мають витягнуту веретеноподібну форму; клітини, що ростуть у суспензії, мають, як правило, сферичну форму.

Клітинну масу для культивування одержують шляхом триптичної обробки відповідного органу; останній розпадається на окремі клітини, що з дотриманням усіх обмежень, викликаних необхідністю дотримання стерильності, переносять на поживне середовище для культивування. Поодинокі еукаріотичні клітини, які не здатні ділитися, швидко гинуть. Враховуючи таку власти-нісь при культивуванні вдаються до створення шару живильних клітин, для чого призначені для клонування клітини наносять на шар клітин, що втратили після опромінення здатність ділитися, а./іг ще па певний час зберегли метаболізм. Цього виявляється до-ста і ін.о, щоб нанесені на цей шар клітини почали ділитися. Однак кількість клітин, що вступили у фазу поділу, віднесена до кількості нанесених на живильне середовище завжди менша 100 %. При додаванні до живильного середовища деяких речовин-мітогенів здатність клітин до поділу підвищується.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Діти з проблемами розвитку	\|	Біотехнологія і гібридизація соматичних клітин

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.014 сек.