Техніка підрахунку формених елементів

Беруть абсолютно чисті і сухі змішувачі (меланжери) і камеру Горяєва. Показником сухості змішувача (меланжера) є вільне переміщення скляної намистини в його резервуарі.

В суху і чисту чашку Петрі наливають рідину для розведення еритроцитів чи лейкоцитів відповідно (на дні чашки підписують назву рідини для розведення).

Більш точний результат можна отримати при меншому розведенні крові. Зазвичай, кров набирається до позначки в меланжері 0,5. Тримаючи змішувач горизонтально, перевіряють, чи набрана кров чітко до позначки. Якщо її набрано трохи більше, надлишок знімається шматочком фільтрувального паперу, який прикладається до кінчика змішувача.

Не випускаючи грушу меланжера, швидко витирають кінчик піпетки чистою ваткою і занурюють його в рідину для розведення. Тримаючи спочатку змішувач під кутом, швидко засмоктують рідину, а коли вона наповнює половину резервуара, переводять у вертикальне положення і продовжують засмоктувати дуже повільно, щоб не насмоктати суміш вище позначки 101 чи 11.

При цьому змішувач злегка обертають вправо і вліво для того, щоб бульбашки повітря, які випадково потрапили в резервуар, вийшли в піпетку вище за нього. Коли рідина піднялася точно до мітки 101 чи 11, кінчик змішувача виймають з рідини і, не випускаючи грушу, затискають середнім пальцем правої руки відкритий кінчик змішувача. Обережно знімають грушу і затискають пальцем другий кінчик меланжера.

Струшуючи змішувач, затиснутий між обома пальцями протягом 3 – 5 хв, добиваються рівномірного розподілу еритроцитів (лейкоцитів) всередині резервуара. Перемішуванню сприяють рухи скляної намистини яка знаходиться в ньому.

Потім, вносять краплю розведеної крові в камеру Горяєва. Щоб внести в камеру рівномірно розведену кров з резервуару, а не вміст нижньої частини змішувача, що складається майже з однієї рідини для розведення, слід перші 2 – 3 краплі суміші випустити, в камеру взяти лише наступну краплю. Якщо змішувач до внесення краплі в камеру деякий час лежав, то безпосередньо перед наповненням камери його знову слід струшувати впродовж 1 – 2 хв.

При наповненні камери Горяєва треба пильнувати, щоб в неї не потрапила бульбашка повітря. Якщо це сталося, то легким постукуванням по поверхні покривного скла намагаються перевести бульбашку в канавку навколо пластинки з сіткою. Коли це не вдається, покривне скло знімають, ретельно витирають його і камеру і наповнюють її знову.

Наповнивши камеру Горяєва, кладуть її горизонтально, очікують 1 – 2 хв, поки клітини осядуть на дно, потім поміщають предметне скло з камерою на столик мікроскопа і проводять підрахунок (Рис 2.13).

Спочатку користуються малим збільшенням ×8, щоб швидше знайти сітку, підрахунок роблять при збільшенні ×40. Якщо при розгляданні під малим збільшенням відразу видно, що еритроцити розподілені в окремих великих квадратах абсолютно нерівномірно, то дослідження потрібно почати спочатку.

Підрахувавши один вид клітин, камеру Горяєва розбирають, миють, сушать, знову збирають і проводять підрахунок іншого виду клітин.

Рис 2.13

Дуже важливо для отримання точного результату не лічити двічі одні і ті ж клітини. Для цього треба дотримуватися наступних правил: рахунок вести в малих квадратах; рахувати тільки ті клітини, які знаходяться усередині малого квадрата; клітини, що лежить на пограничних лініях між двома малими квадратами, вважати лише тоді, коли вони більшою своєю частиною лежать усередині квадрата. Якщо погранична лінія перетинає клітину навпіл, рахують тільки ті з них, які лежать на верхній і правій межах малого квадрата або на верхній і лівій, або на нижній і правій, або на нижній і лівій, тобто завжди на двох одних і тих же межах квадрата, з яких одна горизонтальна, а інша вертикальна. Клітини більшою своєю частиною розташовані поза даним квадратом, не рахуються (вони потраплять в підрахунок при лічбі числа еритроцитів в сусідньому квадраті, в яких вони лежать більшою своєю частиною)

Зазвичай обмежуються підрахунком клітин в 5 великих квадратах, тобто у 80 малих. Однак, чим в більшій кількості великих квадратів буде проведено підрахунок, тим результати підрахунку будуть точніші. Враховуючи можливість нерівномірного розподілу клітин в камері підрахунок робиться в 5 великих квадратах, що не примикають однин до одного.

Методика підрахунку числа еритроцитів і лейкоцитів.Для обчислення кількості еритроцитів за основу береться середнє число еритроцитів в одному малому квадраті. Для цього числа еритроцитів, підрахованих в 80 малих квадратах (5 великих), ділять на 80. Оскільки об’єм тієї частини камери, яка відповідає одному малому квадрату, дорівнює 1/4000 мм³, для числа еритроцитів в 1 мм³ розведеної крові слід середнє число еритроцитів в одному малому квадраті помножити на 4000. Але в камері знаходиться не чиста кров, а розведена в 200 разів, тому для числа еритроцитів в 1 мм³ нерозведеної крові слід отримане після множення число ще помножити на ступінь розведення, тобто на 200. Таким чином, число еритроцитів, знайдене в 5 великих квадратах, ділять на 80 і множать на 800 000 (4000×200) або, що є тим же самим, відразу множать на 10 000.

де Е – кількість еритроцитів в 1 мм³ крові;

n – кількість еритроцитів підрахована в 80 малих квадратах;

200 – розведення крові.

Приклад. В 5 великих квадратах підрахували 360 еритроцитів. Це означає, що в 1 мм³ крові міститься: 360/80×4000×200 = 360×10 000 = 3 600 000 еритроцитів, тобто 3,6×10⁶ клітин в 1 мм³ крові.

Для підрахунку лейкоцитів слід підрахувати число клітин у 100 великих квадратах. Отримане число ділять на 1600, щоб знайти середню кількість лейкоцитів в одному малому квадраті. Це число множать на 4000 (так як об’єм камери, що відповідає малому квадрату, дорівнює 1/4000 мм³) і на 20 (тобто на ступінь розведення).

де Л – кількість лейкоцитів в 1 мм³ крові;

n – кількість лейкоцитів підрахована в 400 малих (25 великих) квадратах;

20 – розведення крові.

Після закінчення підрахунку необхідно вимити змішувачі; з них видувають залишок крові і багаторазово промивають змішувачі шляхом поперемінного втягування і видування спочатку води, потім спирту і, нарешті, ефіру. Після цього надягають гумовий балон місткістю в 100 – 200 см³ і кілька разів продувають через змішувач повітря для того, щоб остаточно його висушити.

Камеру Горяєва слід витирати насухо м’якою замшевою ганчірочкою, щоб не зіпсувати нанесення сітки.

Завдання на виконання:

1. Відібрати самостійно кров з хвостової вени щурів: 1 – 2 краплини крові крапнути на предметне скло та кілька краплин відібрати у пробірку, попередньо крапнувши на предметне скло та у пробірку гепарин.

2. Приготувати мазки крові, використовуючи кров людини та тварин (щурів).

Поетапне приготування мазка крові

	Крок. 1 Помістити невелику краплю крові на один кінець предметного скла. Тримати скло в горизонтальному положенні
	Крок 2. Розташувати допоміжне скельце під кутом 45° до основного, на яке нанесена краплина крові. Дати краплині крові розтектися по шліфу допоміжного скельця
	Крок 3. Протягнути краплю крові по предметному склу, швидко просуваючи допоміжне предметне скельце до краю основного.
	Крок 4. Мазок має бути тонким, закінчуватися «віничком». Мазок швидко підсушити на повітрі.

3. Підсушити мазки, підписати олівцем та залишити до наступного заняття.

4. У зразках крові, які були відібрані у пробірки провести кількісний облік клітин: визначити відсоток лейкоцитів, еритроцитів та тромбоцитів за допомогою камери Горяєва.

5. Визначити життєздатність клітинних суспензій еритроцитів та лейкоцитів:

Розчини трипанового синього та еозину пропускають крізь паперовий фільтр і змішують у співвідношенні 1:1. Додають 0,5 мл одержаного барвника та 0,1 мл суспензії досліджуваних клітин з концентрацією 5×10⁷ клітин/мл. Заповнюють камеру Горяєва і підраховують 100 клітин. Живі клітини безбарвні, мертві клітини мають синьо-фіолетове забарвлення внаслідок проникнення барвника крізь ушкоджену мембрану. Зависина клітин вважається життєздатною, якщо мертві клітини складають не більше 10 – 13%.

6. Порівняти значення отриманої лейкоцитарної формули аналізованої крові з нормальними показниками.

7. Оформити протокол заняття, зробити висновки.

Контрольні запитання:

1. Чому еритроцитам та тромбоцитам не потрібне ядро?

2. В чому полягають особливості будови лейкоцитів?

3. Яка клітина є центральною клітинною в імунній системі?

4. Що таке лейкоцитарна формула?

5. Камера Горєва, техніка підрахунку.

6. Техніка приготування сумішей еритроцитів та лейкоцитів для визначення концентрації клітин.

7. Меланжер, будова, правила використання.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Відбір і підготовка зразка крові. Змішувач (меланжер).	\|	ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 3

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.005 сек.