Полімеразно ланцюгова реакція

Висновки методу обриву послідовності ланцюга

Послідовність читання флуоресцентно мічені реакції

Послідовність читання радіоактивно міченої реакції

Послідовність розподілу

Припинені ланцюги повинні бути відокремлені

Потрібна одна пара основ резолюції

-Дивіться різницю між ланцюгами X і X +1 пар основ

Гель електрофорез

-дуже тонкий гель

-висока напруга

-робота з радіоактивними або флуоресцентними мітками

Визначення розміщення кожної з основ в послідовності вимагає розділення припинення ланцюгів і їх вирішення(resolving), так що можна побачити відмінності одній базі. Це означає, наприклад, що ланцюг довжиною 35 основ повинні буде відрізнятися від ланцюга 34 або 36 основ. Цей крок, як правило, здійснюється за допомогою електрофорезу за допомогою гелю або капіляру. Спочатку, були використані дуже тонкі гелі, з застосуванням високої напруги. Або радіоактивно мічені або флуоресцентно мічені продукти реакції можуть бути розділені на гелі. Зображена в цьому слайд-шоу авторадіограмми типова послідовність геля з смугами позначені відповідно до дидезоксі термінатора. Для гелю-електрофорезу, негативний полюс був зверху, а позитивний полюс внизу.

Радіоактивні помічені реакції

- Гель сушать( Gel dried)

- Розміщують на рентгенівській плівці

Послідовність читається знизу вгору

Кожна смуга являє собою різні основи

На заключному етапі секвенування, щоб прочитати послідовності. Після радіоактивного мічення послідовності реакцій проходять через гель, гель сушать, а потім розміщують на рентгенівській плівці. Після фільму «розвивається», положення кожної групи стає видимим. Послідовність потім читають з нижньої частини гелю на вершину, з кожної з чотирьох смуг даючи позицію іншої основи: A, T, C або G.

Флуоресцентно мічені реакції сканується лазером, що в певний момент передається ( чи в певний момент минає??)

Колір підібраний детектором

Вихідні дані направляється безпосередньо до комп'ютера

Для флуоресцентно мічених реакцій, які розділяються або гелем-електрофорезом або через капіляри, фрагменти виявлені лазером, як вони проходять певну точку. Кожен з чотирьох кольорів підібраний за допомогою детектора, а вихідні дані надходять безпосередньо на комп'ютер. Зчитування дається як з точки зору основ і з точки зору інтенсивності кожного кольору, так що неоднозначні свідчення легко ідентифікуються.

На картинці наведені кроки секвенування ДНК. Праймер подовжується ДНК-полімеразою на основі послідовності, що присутня . Ланцюг переривається різними дидезоксінуклеотидами які додаються до матричного ланцюга. Чотири реакції, по одному для кожної основи, розділені на гелі, який може вирішити одну базу відмінності. Послідовність потім читають з нижньої частини гелю на верх.

Використовується в послідовності, діагностики, порівняльній геноміці і т.д.

Використання термостабільної ДНК-полімерази

- Здатна працювати майже при температурі кипіння

Два праймери, комплементарні послідовності в 5 'і 3' регіонах будуть ампліфікуватися

Дволанцюгова ДНК матриця

Використання термоциклів, запрограмованих для підйому та опускання температури

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) революція в біології, коли вона була введена в 1980 році. В даний час використовується в послідовності, діагностиці, порівняльній геноміці, і інших областях. Прорив в цій технології прийшли з відкриттям термостабільних полімераз ДНК, виділених з бактерій, які живуть в киплячій воді гейзерів. Термостабільні полімерази, як і всі ДНК-полімерази, потребують матриці і праймерів для роботи. Для ПЛР-, двох праймерів, однин додається до 5 'кінця матриці буде посилюватися й інший додається до 3' кінця.Матриця , як правило, дволанцюгова ДНК. Реакція проводиться в термоциклі, також відомих як машина ПЛР, який запрограмований, щоб піднімати і опускати температуру реакції дуже швидко і точно.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Виявлення послідовності	\|	Білково-експресуючі вектори

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.