Створення бібліотек

Кроки геномного секвенування

Автоматичне читання гелю

Автоматизований секвенатор MegaBACE

Зроблений Amersham

Має 96 капілярів, робот завантажує 384 ямкових пластин, за2- 4 години читає 800 основ

Основним конкурентом ABI 3700 є MegaBACE 4000, зроблений Amersham. Він також має 96 капіляри і робот виконує навантаження від 384-ямковий пластин для мікротитрування. Це займає від двох до чотирьох годин в перспективі і може читати до 800 баз точно.

Верхнє зображення: конфокальна детекція секвенсора MegaBACE флуоресцентно мічених ДНК

Нижнє зображення: комп'ютерне зображення послідовності яку читає автоматизований секвенатор

Обидва автоматизовані секвенсори виявляють флуоресцентно мічені ланцюги ДНК, коли вони проходять через капіляри. Секвенатор MegaBACE використовує конфокальні системи візуалізації, що показано у верхньому зображенні. Зчитування даних у вигляді піків флуоресценції, яке показано на нижньому зображенні.

Створення бібліотек

- Велико-вставочні бібліотеки з генома

Процес секвенування

- Створенні фрагменти мають бути впорядковані

- Виконання послідовності реакцій

- Визначення послідовності

Обробка( заключний етап)

- Збирання безперервних послідовностей

- Усунення прогалин

Секвенування генома може бути розбите на кілька етапів. По-перше, створення бібліотек великих фрагментів геномної ДНК. Друга стадія процес секвенування сама по собі може бути розба на більш дрібні кроки. Ці кроки включають в себе створення невеликих фрагментів ДНК, які повинні бути послідовними, виконують поточні реакції секвенування, і запуск реакції через автоматизований секвенатор. Третій етап обробки, і вона включає в себе збірку вихідних послідовностей які складаються в безперервні послідовності, а потім заповнення прогалин які залишилися у послідовності.

Бібліотека геномних фрагментів, зроблена у векторах

- BAC, PAC, або YAC

Зазвичай мають у декілька разів охоплення (coverage)

Кожна послідовність ДНК має від п'яти до восьми різних клонів

Важкі і неефективні послідовності безпосередньо з великих фрагментів

Потребують усунення на керовані частини

Випадково порізані

За допомогою рестрикраз або ультразвуком

Перший крок у великомасштабному секвенуванні, як правило, підготовка бібліотеки великих фрагментів геномної ДНК. Сьогодні, вектори, які найчастіше використовуються це BACs або PACs, але іноді YACs теж використовуються. Бібліотеки, як правило, зроблені з фрагментів досить великого розміру, щоб утримувати кілька разів охоплення генома, це означає, що будь-яка послідовність буде знайдена, в 5-8-ми копіях. Це важко і неефективно секвенувати безпосередньо від великих фрагментів, наступним кроком є звільнення кожного клону на керовані частини. Це робиться шляхом випадкового розрізання ДНК з кожного клону ультразвуком або за допомогою рестрикраз. Можуть бути отримані таким чином випадково порізані фрагменти певного розміру (наприклад, 2 Кб).

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Автоматизований секвенатор ABI 3700	\|	Обробка (Finishing) 1

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.004 сек.