Обробка (Finishing) 1

Зчитування зібраної послідовності

Послідовність складання

Фрагменти для секвенування

Як правило, використовують частини 2-10 кб для секвенування

Клонування в векторі секвенування

Містить сайти зв'язування праймерів для секвенування

Можуть бути одноланцюгові або дволанцюгові

Процес секвенування, як правило, здійснюється на фрагментах 2-10 Кб. Ці випадково порізані фрагменти повинні бути субклоновані в векторі секвенування, який містить сайти зв’язування з праймерими, що використовуються для ініціювання реакції секвенування. Векторів секвенування може бути одноланцюговий, як вектор фага М13, або дволанцюговий як плазміди.

Випадкові послідовності

Спочатку збираються в перекриваючі послідовності

Потім створюють одну безперервну послідовність

Програма, що використовується для цієї операції називається PHRAP

Аналізує кожну позицію, щоб визначити наступне:

Якість послідовність

Узгодження послідовностей в подібному регіоні

Отримані з різних випадкових фрагментів

Випадкові послідовності генерується з порізаних фрагментів спочатку їх збирають у перекриваючі послідовності. В залежності від бажаного охоплення, цьому кроку може знадобитися до 10 читань кожної частини ДНК. З цих перекриваючих послідовностей, складають одну безперервну послідовність. Ця задача, як правило, здійснюється з використанням автоматизованої програми для редагування відомої як PHRAP, розробленої Phil Green. Програма аналізує кожну позицію в послідовності і визначає якість кожного читання. Вона генерує послідовність консенсусу на основі різних послідовностей, що отримані з того ж регіону та їх внутрішньої узгодженості (тобто, як часто така ж основа буде знайдена в будь-якій позиції).

Зчитування програмою PHRAP, показує як перекриваючі послідовності вишикувалися в одну безперервну послідовність.

Процес складання необроблених послідовностей читання в точну безперервну послідовність

Потрібна точність 1/10, 000

Управління процесом

Подивіться на послідовність читання в позиціях, де програма не може сказати, які основи є правильним

Усунення прогалин

Забезпечення адекватного охоплення

Хоча автоматизовані програми для редагування, такі як PHRAP значно підвищити ефективність секвенування, все одно залишається потреба в людських судженнях і втручаннях. Це відбувається під час останнього кроку обробки (finishing), який визначається як процес складання необробленої послідовності читання в точну безперервну послідовність генома. Для геномних послідовностей з точністю до однієї помилки на 10000 основи, крок ручної обробки має важливе значення. Дослідник дивиться на позиції, де автоматизована програма для редагування не може сказати, які основи є правильними. Досліджуючи різні необроблені послідовності читання, дослідник потім робить судження щодо правильної підстави або посилає ці області на додаткове секвенування. Аналогічним чином, коли є прогалини в послідовності або недостатнє охоплення, дослідник буде сигналізувати регіон і відправить його назад у процес секвенування для додаткової обробки.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Створення бібліотек	\|	Картування на основі секвенування 1

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.007 сек.