Реактиви

1. Веронал-мединаловий буфер (рН 8,6; іонна сила 0,1): у 500 мл дистильованої води розчиняють 17,52 г мединалу, додають 2,76 г вероналу і, переміщуючи, нагрівають у теплій водяній бані до розчинення вероналу. Тоді об’єм розчину доводять дистильованою водою до 1 л.

2. Агар – 1 % розчин. Агар повинен бути чистим і прозорим. Готують 2 % розчин на дистильованій воді. Гарячий розчин розливають у ванночки товщиною 1,0–1,5 см. Після застигання агарову пластинку розрізають на кубики, переносять їх у товстостінний стакан і промивають протягом двох діб під проточною водопровідною водою, тоді протягом доби – дистильованою водою, змінюючи її чотири–п’ять разів. Агар підсушують фільтрувальним папером, переносять у колбу, розігрівають, гарячий розчин розводять у два рази буферним розчином і тричі фільтрують через три шари марлі. Розчин агару зберігають у холодильнику. Перед нанесенням на пластинку його нагрівають на киплячій водяній бані доти, поки в агарі не зникнуть пухирці повітря.

3. Амідовий чорний 10Б – 0,1 % розчин у 2 % оцтовій кислоті.

4. СН₃СООН – 5 % розчин.

Приготування агарових пластинок і проведення електрофорезу.Для приготування агарових пластинок використовують предметні скельця. Попередньо їх знежирюють, ретельно промивають водою і висушують. Скельця нумерують, викладають на строго горизонтальну поверхню і на кожне скельце обережно наливають піпеткою із широким носиком 4 мл агару. Пухирці повітря в агарі необхідно вивести піпеткою на край скла. Коли агар застигне і утвориться твердий гель, у ньому посередині вирізають лунку (кишеньку) для внесення досліджуваного розчину. Підготовлені скельця складають в електрофоретичну камеру. Агарове плато з’єднують з буферним розчином містками з фільтрувального паперу. В кожну лунку на пластинці вносять сироватку крові, попередньо розведену буферним розчином. На електрофореграму наносять приблизно по 100–300 мкг білка в об’ємі 0,01 мл. Прилад підключають до джерела струму. Повільно підвищуючи напругу, доводять силу струму до 20–25 мА (за напруги 200–300 В), електрофорез проводять протягом 3–4 год.

Обробка агарових пластинок. Після завершення електрофорезу струм вимикають, предметні скельця з агаровим гелем відразу виймають з камери і поміщають на 30 хв у 5 % розчин СН₃СООН. Кожну пластинку покривають смужкою фільтрувального паперу, змоченого в 5 % розчині СН₃СООН, для видалення води та солей, а згодом висушують за кімнатної температури протягом ночі. Для пришвидшення процесу висушування його проводять при 37 °С або під потоком теплого повітря. Папір, який може приклеїтися до агарового шару, обережно знімають, попередньо розмочивши його водою. Перед зафарбовуванням агарове поле повинне бути абсолютно сухим і прозорим. Зафарбовування зразків на електрофореграмах проводять амідовим чорним 10Б протягом ночі. Фарбу, яка не зв’язалася з білками, відмивають 5 % розчином СН₃СООН. Відмиті електрофореграми висушують при 37 °С.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Електрофорез білків сироватки крові в агаровому гелі	\|	Загальний клінічний аналіз крові

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.