Реактиви

1. Етиловий спирт – 70 º розчин.

2. Фізіологічний розчин – 0,9 % розчин натрій хлориду.

3. Натрій цитрат – 5 % розчин.

4. Натрій гідроксид – 0,1 н розчин (рН 12,7), зберігають у запарафінованій пляшці в холодильнику.

5. Амоній сульфат – 50 % розчин: до 100 мл розчину (NН₄)₂S0₄ додають 0,85 мл концентрованої хлоридної кислоти.

6. Аміак – 0,04 % розчин: 0,40 мл 25 % аміаку доводять до 25 мл дистильованою водою.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Готують цитратну кров: до 500 мкл крові додають 50 мкл 5 % розчину натрій цитрату (правильне співвідношення крові і антикоагулянту (в даному випадку натрій цитрату) 10:1. Кров з антикоагулянтом переносять у центрифужні пробірки. Якщо об’єм крові невеликий (від 0,2 до 0,5 мл), то можна проводити центрифугування в пробірках типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар (плазма) відсмоктують пастерівською піпеткою або за допомогою шприца з довгою голкою і виливають. Еритроцити тричі промивають охолодженим фізіологічним розчином (0,9 % розчин натрій хлористого) при 3 000 об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою у співвідношенні 1:2 (еритроцитарна маса : дистильована вода). Суміш перемішують протягом 10 хв і центрифугують 10 хв при 8 000 об/хв для відділення стром еритроцитів. За допомогою шприца з довгою голкою відбирають супернатант (гемолізат) і переносять в чисту пробірку Еппендорф.

До 0,2 мл водного розчину гемолізату додають 1,8 мл 0,1 н NаОН і секундоміром фіксують час 1 хв. Через 1 хв проводять осадження, додаючи 4,0 мл 50 % розчину амоній сульфату. Відразу після цього суміш добре перемішують і фільтрують через подвійний знезолений фільтр. На фільтрі залишається гемоглобін А, а фільтрат містить гемоглобін F, який визначають спектрофотометрично при довжині хвилі 541 нм.

Контрольну пробу, за якою обчислюють загальний вміст гемоглобінів (А + F), готують так: до 0,1 мл гемолізату додають 5,9 мл 0,04 %розчину NН₄ОН і міряють екстинкцію при довжині хвилі 541 нм. Процент гемоглобіну F розраховують за формулою:

де Е₁ – екстинкція досліджуваного розчину після осадження гемоглобіну А; Е₂ – екстинкція контрольної проби; 2 – коефіцієнт для порівняння концентрацій.

§ Метод К. Зінгера у модифікації Н. О. Сибірної

Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, піпетки, груші, дозатори, годинник, центрифуга, центрифужні пробірки, пробірки типу Еппендорф, знезолений фільтр, лійка, рукавички.
Читайте також:
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Реактиви
Тонічним розчином натрію хлориду (1 :500, 1 : 700), а потім додають реактиви, які викликають лізис еритроцитів (сапонін, сапоглобін).

Переглядів: 597

<== попередня сторінка | наступна сторінка ==>

Визначення вмісту лужностійкого гемоглобіну | Реактиви

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.