Студопедия
Новини освіти і науки:
МАРК РЕГНЕРУС ДОСЛІДЖЕННЯ: Наскільки відрізняються діти, які виросли в одностатевих союзах


РЕЗОЛЮЦІЯ: Громадського обговорення навчальної програми статевого виховання


ЧОМУ ФОНД ОЛЕНИ ПІНЧУК І МОЗ УКРАЇНИ ПРОПАГУЮТЬ "СЕКСУАЛЬНІ УРОКИ"


ЕКЗИСТЕНЦІЙНО-ПСИХОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ПОРУШЕННЯ СТАТЕВОЇ ІДЕНТИЧНОСТІ ПІДЛІТКІВ


Батьківський, громадянський рух в Україні закликає МОН зупинити тотальну сексуалізацію дітей і підлітків


Відкрите звернення Міністру освіти й науки України - Гриневич Лілії Михайлівні


Представництво українського жіноцтва в ООН: низький рівень культури спілкування в соціальних мережах


Гендерна антидискримінаційна експертиза може зробити нас моральними рабами


ЛІВИЙ МАРКСИЗМ У НОВИХ ПІДРУЧНИКАХ ДЛЯ ШКОЛЯРІВ


ВІДКРИТА ЗАЯВА на підтримку позиції Ганни Турчинової та права кожної людини на свободу думки, світогляду та вираження поглядів



Реактиви

1. Етиловий спирт – 70 º розчин.

2. Фізіологічний розчин – 0,9 % розчин натрій хлориду.

3. Натрій цитрат – 5 % розчин.

4. Натрій гідроксид – 1,2 н розчин.

5. Розчин Драбкіна: NаНСО3 – 1 г; КСN – 0,05 г; К3[Fe(CN)6] – 0,2 г; дистильованої води – до 1,0 л.

6. Амоній сульфат – насичений розчин: однакові об’єми (NН4)2S04 і дистильованої води нагрівають протягом 10 хв до +70 ºС, гарячий розчин фільтрують; при охолодженні амоній сульфат викристалізовується.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Готують цитратну кров: до 0,1–0,2 мл крові додають 0,01–0,02 мл 5,0 % розчину натрій цитрату (правильне співвідношення крові і антикоагулянту (в даному випадку натрій цитрату) 10:1). Кров з антикоагулянтом переносять у пробірки типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування цитратної крові в пробірках Еппендорф при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар плазми відсмоктують за допомогою шприца з довгою голкою і виливають. Еритроцити тричі промивають охолодженим фізіологічним розчином (0,9 % розчин натрій хлористого) при 3 000 об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою, додаючи до 0,05 мл еритроцитарної маси 0,10 мл дистильованої води. Суміш перемішують протягом 10 хв і центрифугують 10 хв при 8 000 об/хв для відділення стром еритроцитів. За допомогою шприца з довгою голкою відбирають супернатант (гемолізат) і переносять в чисту пробірку Еппендорф.

Для визначення концентрації гемоглобіну з отриманого гемолізату відбирають 0,02 мл, додають 5 мл розчину Драбкіна і через 20 хв вимірюють екстинкцію розчину при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі шириною 10 мм проти контролю – розчину Драбкіна на фотоелектроколориметрі.

Концентрацію гемоглобіну обчислюють за формулою:

СНв = Е540 × 251 × 1,45,

де СНв – концентрація гемоглобіну в гемолізаті, г/л, або мг/мл; 251 – розведення; 1,45 – коефіцієнт перерахунку.

Отже, гемоглобін, який містився в отриманому гемолізаті перевели у ціанметформу і визначити його концентрацію. Якщо в гемолізаті міститься приблизно 10 г% гемоглобіну, то до отриманого розчину ціанметгемоглобіну додають реактив Драбкіна до кінцевої концентрації 0,5 г%.

Приклад розрахунку. Розведення ціанметгемоглобіну = 10 г% / 0,5 г% = 20 раз. Таким чином, з 5 мл розчину ціанметгемоглобіну, який фотометрували, відбираємо 0,5 мл і доводимо до 10 мл реактивом Драбкіна.

Відбирають 2,8 мл розведеного розчину ціанметгемоглобіну і ретельно змішують з 0,2 мл 1,2 н NаОН. Рівно через 2 хв додають 2,0 мл насиченого розчину амоній сульфату. Старанно перемішують вміст пробірки. Гемоглобін А випадає в осад, а гемоглобін F залишається у розчині. Осад відфільтровують через подвійний фільтр. Отриманий фільтрат фотометрують Е1 проти холостої проби при довжині хвилі 540 нм.

Холосту пробу готують так: 0,4 мл 0,5 г% розчину ціанметгемоглобіну змішують з 6,75 мл дистильованої води. Ця проба дає екстинкцію вихідної кількості гемоглобіну Е2 (у співвідношенні 1:10).

Розрахунки проводять за формулою:

 

 


Читайте також:

  1. Реактиви
  2. Реактиви
  3. Реактиви
  4. Реактиви
  5. Реактиви
  6. Реактиви
  7. Реактиви
  8. Реактиви
  9. Реактиви
  10. Реактиви
  11. Тонічним розчином натрію хлориду (1 :500, 1 : 700), а потім додають реактиви, які викликають лізис еритроцитів (сапонін, сапоглобін).




Переглядів: 672

<== попередня сторінка | наступна сторінка ==>
Реактиви | Кількісне визначення термолабільного гемоглобіну

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

  

© studopedia.com.ua При використанні або копіюванні матеріалів пряме посилання на сайт обов'язкове.


Генерація сторінки за: 0.008 сек.