Реактиви

1. Етиловий спирт – 70 º розчин.

2. Фізіологічний розчин – 0,9 % розчин натрій хлориду.

3. Натрій цитрат – 5 % розчин.

4. Натрій гідроксид – 1,2 н розчин.

5. Розчин Драбкіна: NаНСО₃ – 1 г; КСN – 0,05 г; К₃[Fe(CN)₆] – 0,2 г; дистильованої води – до 1,0 л.

6. Амоній сульфат – насичений розчин: однакові об’єми (NН₄)₂S0₄ і дистильованої води нагрівають протягом 10 хв до +70 ºС, гарячий розчин фільтрують; при охолодженні амоній сульфат викристалізовується.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Готують цитратну кров: до 0,1–0,2 мл крові додають 0,01–0,02 мл 5,0 % розчину натрій цитрату (правильне співвідношення крові і антикоагулянту (в даному випадку натрій цитрату) 10:1). Кров з антикоагулянтом переносять у пробірки типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування цитратної крові в пробірках Еппендорф при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар плазми відсмоктують за допомогою шприца з довгою голкою і виливають. Еритроцити тричі промивають охолодженим фізіологічним розчином (0,9 % розчин натрій хлористого) при 3 000 об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою, додаючи до 0,05 мл еритроцитарної маси 0,10 мл дистильованої води. Суміш перемішують протягом 10 хв і центрифугують 10 хв при 8 000 об/хв для відділення стром еритроцитів. За допомогою шприца з довгою голкою відбирають супернатант (гемолізат) і переносять в чисту пробірку Еппендорф.

Для визначення концентрації гемоглобіну з отриманого гемолізату відбирають 0,02 мл, додають 5 мл розчину Драбкіна і через 20 хв вимірюють екстинкцію розчину при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі шириною 10 мм проти контролю – розчину Драбкіна на фотоелектроколориметрі.

Концентрацію гемоглобіну обчислюють за формулою:

С_Нв = Е₅₄₀ × 251 × 1,45,

де С_Нв – концентрація гемоглобіну в гемолізаті, г/л, або мг/мл; 251 – розведення; 1,45 – коефіцієнт перерахунку.

Отже, гемоглобін, який містився в отриманому гемолізаті перевели у ціанметформу і визначити його концентрацію. Якщо в гемолізаті міститься приблизно 10 г% гемоглобіну, то до отриманого розчину ціанметгемоглобіну додають реактив Драбкіна до кінцевої концентрації 0,5 г%.

Приклад розрахунку. Розведення ціанметгемоглобіну = 10 г% / 0,5 г% = 20 раз. Таким чином, з 5 мл розчину ціанметгемоглобіну, який фотометрували, відбираємо 0,5 мл і доводимо до 10 мл реактивом Драбкіна.

Відбирають 2,8 мл розведеного розчину ціанметгемоглобіну і ретельно змішують з 0,2 мл 1,2 н NаОН. Рівно через 2 хв додають 2,0 мл насиченого розчину амоній сульфату. Старанно перемішують вміст пробірки. Гемоглобін А випадає в осад, а гемоглобін F залишається у розчині. Осад відфільтровують через подвійний фільтр. Отриманий фільтрат фотометрують Е₁ проти холостої проби при довжині хвилі 540 нм.

Холосту пробу готують так: 0,4 мл 0,5 г% розчину ціанметгемоглобіну змішують з 6,75 мл дистильованої води. Ця проба дає екстинкцію вихідної кількості гемоглобіну Е₂ (у співвідношенні 1:10).

Розрахунки проводять за формулою:

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Реактиви	\|	Кількісне визначення термолабільного гемоглобіну

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.003 сек.