Реактиви

1. Натрій цитрат – 5 % розчин або будь-який інший антикоагулянт.

2. Фізіологічний розчин – 0,85 % розчин натрій хлориду.

3. Фосфатний буфер – 0,1 М розчин, рН 7,4: для приготування буфера готують два розчини солей натрій фосфату. Розчин А – 7,8 г однозаміщеного натрій фосфату (NаН₂РО₄ × Н₂О) доводять дистильованою водою до 500 мл; розчин В– 7,1 г двозаміщеного натрій фосфату (Nа₂НРО₄) доводять дистильованою водою до 500 мл. Змішують 19,2 мл розчину “А” і 80,8 мл розчину “В”, рН розчину доводять до 7,4.

4. Аміак – 0,04 % розчин (NН₄ОН): 0,40 мл 25 % аміаку доводять до 25 мл дистильованою водою.

Хід роботи

Готують цитратну кров: до 0,1 мл крові додають 0,01 мл 5,0 % розчину натрій цитрату. Кров з антикоагулянтом переносять у пробірки типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування цитратної крові в пробірках типу Еппендорф при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар плазми відсмоктують за допомогою шприца з довгою голкою і виливають.

Еритроцити з 0,1 мл цитратної крові відмивають двічі у 1,0 мл фізіологічного розчину. До осаду відмитих еритроцитів додають 0,5 мл дистильованої води і перемішують. Додають 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) і перемішують. Центрифугують 10 хв при 3 000 об/хв. Із супернатанту відбирають 0,2 мл забуференого гемолізату і вносять у пробірку з 3,4 мл 0,04 % розчину аміаку. Після перемішування визначають оптичну густину на спектрофотометрі у 10 мм кюветі при довжині хвилі 540 нм. Контрольним розчином є аміак. Дані цієї екстинкції (Е₁) до інкубації приймають за 100 % гемоглобіну.

Забуферений гемолізат у кількості 0,5 мл інкубують у водяній бані при температурі +55 °С протягом 1 год, після чого центрифугують 10 хв при 3 000 об/хв. Із супернатанту відбирають 0,2 мл і вносять його у пробірку з 3,4 мл 0,04 % розчину аміаку. При довжині хвилі 540 нм визначають екстинкцію розчину Е₂. Дані цієї екстинкції відповідають термостабільному гемоглобіну. Вміст термостабільного гемоглобіну вираховують за формулою:

де Х – відсоток термостабільного гемоглобіну (у нормі, на його частку припадає 90–92 % і більше). Процент термолабільної фракції становить 100 % – х.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Кількісне визначення термолабільного гемоглобіну	\|	Визначення вмісту глікозильованого гемоглобіну

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.004 сек.