Мікрохімічний та гістологічний аналіз лрс

Гістохімічні реакції використовують для встановлення ідентичності лікарської рослинної сировини. За допомогою цих реакцій можна виявити ті чи інші сполуки безпосередньо в клітинах і тканинах, де вони локалізуються. Гістохімічні реакції проводять на свіжих або фіксованих зрізах матеріалу; у деяких випадках можна використовувати висушений матеріал. Результати реакції розглядають під мікроскопом. Більшість гістохімічних реакцій потрібно проводити швидко, щоб не відбулась дифузія досліджуваної речовини і не зруйнувались тканини під впливом реактиву. За допомогою гістохімічного аналізу також можна перевірити доброякісність сировини (наприклад, сильне здерев'яніння луб'яних волокон кореня алтеї свідчить про недоброякісність даної сировини).

Фітохімічний аналіз

Фітохімічний аналіз ЛРС полягає в проведенні якісного і кількісного визначення діючих, супутніх, екстрактивних речовин, а також вологи і золи. Деякі якісні реакції на окремі речовини (слиз, крохмаль, жирні й ефірні олії та ін.) викладено у главі «Мікрохімічний та гістохімічний аналіз».

Полісахариди. Якісні реакції. Під час змочування зрізу або порошку кореня алтеї розчином амонію гідроксиду або натрію гідроксиду з’являється жовте забарвлення.

Кумарини. Якісні реакції. Для проведення якісних реакцій і хроматографічних досліджень готують витяжку: 3 г подрібненої сировини вкладають у колбу ємністю 100 мл зі шліфом, додають ЗО мл 95 % спирту, закривають повітряним холодильником і кип’ятять на водяній бані 20 хв. Потім витяжку охолоджують і фільтрують.

Лактонна проба. До 3—5 мл фільтрату додають 5 крапель

10 % спиртового розчину калію гідроксиду і нагрівають на водяній бані 5 хв (за наявності кумаринів розчин жовтіє). Потім доливають 5—10 мл очищеної води, перемішують (може з’явитися каламуть або осад за рахунок ліпофільних сполук), а потім додають 10 % розчин хлоридної кислоти до кислої реакції розчину. Виникнення каламуті або осаду свідчить про можливу наявність кумаринів у сировині.

Хромони. Якісні реакції. З концентрованими мінеральними кислотами хромони утворюють солі характерного лимонного кольору, з концентрованими основами — пурпурово-червоне забарвлення. Для проведення якісних реакцій сировину, що містить хромони, екстрагують органічними розчинниками, витяжки упарюють і хроматографують на колонках силікагелю, підбираючи фракції, що містять хромони. Ці фракції упарюють і перекристалізовують із різних розчинників.

Фенологлікозиди. Якісні реакції

1. Фенологлікозиди з вільною гідроксильною групою дають усі реакції, характерні для фенолів (реакції азотосполучення, реакції із залізоамонійними галунами та ін.). Ці реакції використовують для виявлення фенолів на хроматограмах.

2. Готують 5 % відвар з подрібненої сировини, охолоджують і фільтрують. До 1 мл фільтрату додають невеликий кристалик сульфату закисного заліза; спочатку з’являється червонувато - фіолетове забарвлення, яке змінюється на темно-фіолетове, а потім випадає темно-фіолетовий осад (реакція на вміст арбутину).

3. До 1 мл фільтрату (у фарфоровій чашці) додають 4 мл розчину аміаку і по краплі 1 мл 10 % розчину натрію фосфорно - молібденовокислого у хлоридній кислоті. За наявності арбутина з’являється синє забарвлення.

Флавоноїди. Якісні реакції. Для проведення якісних реакцій сировину, що містить флавоноїди, екстрагують органіч­ними розчинниками, екстракт фільтрують і очищають.

1. Ціанідинова реакція. До 1 мл очищеного екстракту додають 2—3 краплі концентрованої хлоридної кислоти і незначну кількість порошку металічного магнію. З’являється забарвлення різного кольору (від жовтого до яскраво-червоного). Забарвлення залежить від будови сполук.

2. До 1 мл очищеного екстракту додають 1—2 краплі 10 % водно - спиртового розчину калію або натрію гідроксиду. З’являється жовте забарвлення.

3. До 1 мл очищеного екстракту додають 1—2 краплі 10 % розчину заліза(ІІІ)хлориду. З’являється коричневе забарвлення.

4. До 1 мл очищеного екстракту додають 3—5 крапель 10 % розчину основного ацетату свинцю. Утворюється осад.

Лігнани. Якісні реакції. Для лігнанів характерні ті самі реакції, що й для інших фенольних сполук.

Антраценопохідні. Якісні реакції

1. При змочуванні внутрішньої поверхні кори крушини 1 -2 краплями 10 % розчину натрію гідроксиду спостерігають криваво-червоне забарвлення.

2. Антраценопохідні з сировини екстрагують спиртовим розчином калію гідроксиду під час кипіння. Після охолодження фільтрат підкислюють хлоридною кислотою до змінення червоно-бурого кольору розчину на жовто-бурий і екстрагують водний розчин діетиловим ефіром. Ефірний розчин збовтують із розчином аміаку, внаслідок чого ефірний шар залишається забарвленим у жовтий колір, а лужний набуває червоного або фіолетового кольору.

3. У суху пробірку вміщують невелику кількість сировини у вигляді грубого порошку. Дно пробірки нагрівають, тримаючи її горизонтально. Антраценопохідні, що містяться в сировині, під час мікропереганяння утворюють жовті пари, які конденсуються на холодних стінках пробірки у вигляді жовтих кристалів. У разі додавання 10 % спиртового розчину натрію гідроксиду вони набувають вишнево-червоного забарвлення.

Дубильні речовини. Якісні реакції

Витяжка: 0,1 г сировини подрібнюють і просіюють через сито з діаметром отвору 1 мм; вміщують у колбу ємністю 250 мл., додають 100 мл. води і нагрівають на водяній бані 20 хв., потім охолоджують і фільтрують. Для того щоб очистити фільтрат, витяжку збовтують у ділильній лійці з хлороформом (1 : 1). Хлороформний шар витяжки відокремлюють, а до водної витяжки додають три об’єми етанолу. Утворений осад відфільтровують і відокремлюють (полісахариди).

1. До 2 мл очищеного фільтрату додають по краплі 1 % розчин желатини. Виникає каламуть, яка зникає у разі додавання надлишку желатини.

2. До 2 мл фільтрату по краплі додають бромну воду (5,0 брому розчиняють в 1 л води) до відчуття запаху брому. За наявності конденсованих дубильних речовин одразу утворюється осад.

3. До 2 мл фільтрату додають кілька крапель 1 % розчину хініну гідрохлориду або іншого алкалоїду. Утворюється аморфний осад.

4. До 2 мл фільтрату додають 2—3 краплі розчину залізоамонійних галунів. З гідролізованими дубильними речовинами утворюється чорно-синє забарвлення, а з конденсованими — чорно-зелене.

5. До 1 мл фільтрату додають 2 мл 10 % розчину оцтової кислоти і 1 мл 10 % розчину середньої солі свинцю ацетату. За наявності дубильних речовин, що гідролізуються, утворюється осад. Осад відфільтровують. До утвореного фільтрату додають 5 крапель 1 % розчину залізоамонієвих галунів та 0,1 г кристалічного натрію ацетату. За наявності конденсованих дубильних речовин виникає чорно-зелене забарвлення.

Іридоїди. Якісні реакції

Іридоїди з сировини екстрагують спиртом і очищають. До 1 мл витяжки додають 0,5 мл реактиву Трим - Хілла (суміш льодяної оцтової кислоти, концентрованої хлоридної кислоти і 0,2 % водного розчину міді сульфату у співвідношенні 20: 1:2). За наявності іридоїдів розчин набуває блакитного кольору.

Сапоніни. Якісні реакції

Готують водну витяжку у співвідношенні 1 : 10.

1. 1,5 мл витяжки енергійно збовтують протягом 1 хв. Утворюється стійка піна.

2. До 1 мл водної витяжки додають 3—4 краплі 10 % розчину ацетату свинцю основного. Утворюється осад.

3. До 1 мл водної витяжки додають 1 мл 1 % спиртового розчину холестерину. Утворення осаду свідчить про стероїдну природу сапонінів.

4. До 1 мл водно-спиртової витяжки додають 1 краплю 10 % розчину заліза(ІІІ) сульфату, 1 мл концентрованої сульфатної кислоти й обережно нагрівають. З’являється синьо-зелене забарвлення.

5. До 2 мл водно-спиртової витяжки додають 1 мл хлороформу і 5—6 крапель концентрованої сульфатної кислоти. Утворюється забарвлення від жовтого до червоного кольору.

6. До 2 мл водно-спиртової витяжки додають 1 мл спиртового розчину ваніліну, 3—4 краплі концентрованої сульфатної кислоти. З’являється червоне забарвлення.

Серцеві глікозиди. Якісні реакції

Із сировини готують екстракт. Очищений екстракт використовують для реакцій виявлення кардіостероїдів, які можна поділити на такі групи:

а) реакції на вуглеводний компонент;

б) реакції на стероїдну частину;

в) реакції на лактонний цикл.

1. До 2 мл водно-спиртової витяжки додають 0,5 мл 1 % розчину хлоридної кислоти, суміш нагрівають на водяній бані. Потім у пробірку додають кілька крапель 10 % розчину натрію гідроксиду і 1 мл реактиву Фелінга. Випадає осад оранжево - червоного кольору, що свідчить про наявність вуглеводів.

2. До 1 мл водно-спиртової витяжки додають 1 мл 90 % розчину трихлороцтової кислоти в метанолі (або етанолі). З’являється синє (синьо-зелене) забарвлення, що свідчить про наявність стероїдної частини.

3. До 1 мл водно-спиртової витяжки додають 1 мл 5 % розчину натрію нітропрусиду, перемішують і обережно по стінці пробірки додають 2—3 краплі 10 % розчину натрію або калію гідроксиду. З’являється червоне забарвлення, яке змінюється на жовте, що свідчить про наявність лактонного кільця.

Алкалоїди. Якісні реакції

Приготування витяжки: 1 г подрібненої сировини (розміри часток не більше ніж 2 мм) вміщують у колбу зі шліфом ємністю 100 мл, заливають 25 мл 1 % розчину хлоридної кислоти нагрівають на водяній бані протягом 30 хв, періодично перемішуючи.

На предметне скло наносять 1 краплю фільтрату і краплю

реактиву і з’єднують їх скляною паличкою. За наявності алкалоїдів у фільтраті на місці з’єднання крапель утворюється осад або каламуть.

1. Реактив Майєра (розчин ртуті дихлориду в розчині калію йодиду) з більшістю алкалоїдів утворює білі або жовті осад.

2. Реактив Вагнера та Бушара (розчин йоду в розчині калію йодиду) з підкисленими водними розчинами солей алкалоїдів утворюють бурі осади.

3. Реактив Драгендорфа (розчин вісмуту нітрату основного калію йодиду й оцтової кислоти) з більшістю алкалоїдів у кислому середовищі утворюють оранжево-червоні або цегля­но-червоні осади.

4. Реактив Марме (розчин кадмію йодиду в розчині калію йодиду) з алкалоїдами утворює білі або жовтуваті осади, якічисто розчиняються в надлишку реактиву.

5. Розчин таніну з солями алкалоїдів утворює білуваті або жовтуваті аморфні осади.

6. 10 % розчин пікринової кислоти з багатьма алкалоїда­ми утворює жовті осади.

7. Реактив Зоннерштейна (розчин фосфорномолібденової кислоти) з багатьма алкалоїдами утворює жовтуватий аморфний осад.

Біологічний аналіз