Методи генетичного конструювання мікроорганізмів in vitro

Суть цієї технології полягає в поєднанні фрагментів ДНК in vitro, тобто в пробірці, з наступним введенням нових генетичних структур у живу клітину. З хімічної точки зору ДНК всіх організмів є однотипною, значить, in vitro можливе поєднання фрагментів ДНК з будь-яких організмів.

В принципі генна інженерія відкриває можливість переміщування генів в межах усіх живих організмів.

Техніка генетичної інженерії вперше дозволила одержати індивідуальні фрагменти ДНК в достатній кількості з геномів будь-якого ступеня складності. В поєднанні з методами швидкого визначення послідовності основ у ДНК цятехніка вперше відкрилися дослідникам шлях до вивчення будови генів вищих організмів, у т.ч. і людини.

Генетична інженерія починається зі з'ясування основних принципів цієї техніки. Головним філософським підсумком розвитку сучасної біології стало виявлення дивовижної універсальності життя на молекулярному рівні. І дійсно, у всіх живих системах носієм генетичної інформації є нуклеїнові кислоти (ДНК або інколи РНК), до того ж інформація записана на мові універсального генетичного коду. Молекула АТФ стала загальним носієм енергії у всіх живих клітинах. Двадцять амінокислот складають білки всіх живих організмів і т.д.

Для дослідників особливо важливо те, що відтворення макромолекул у живих системах теж підпорядковується загальним принципам. Так, для процесів подвоєння ДНК (реплікації), матричного синтезу РНК (транскрипції) та синтезу білка (трансляції) суттєвою є послідовність нуклеотидів матриці на початку та при закінченні процесів і невелике значення має послідовність між цими специфічними сайтами. Тому ця обставина дозволяє створити такі гібридні молекули ДНК, які б стабільно реплікувались після внесення в реципієнту клітину, і навіть в такі, в яких чужорідна генетична інформація буде експресувати, тобто керувати синтезом чужого білка.

Типовий експеримент в генетичній інженерії складається із таких етапів:

1) одержання фрагменту або суміші фрагментів ДНК;

2) конструювання in vitro рекомбінованих молекул ДНК, які складаються з фрагментів, одержаних на першому етапі, і невеликих автономно реплікуючих в клітині-реципієнті структур (плазмід, фагів, вірусів), яких називають векторами;

3) введення рекомбінованих молекул ДНК в клітину-реципієнт;

4) відбір клонів, які несуть рекомбіновану молекулу.

Плазміда - вектор і чужорідна ДНК розщеплюються ендонуклеазною рестрікцією (в даному випадку ЕсоRІ), утворюючи фрагменти лінійної двониткової ДНК з комплементарними "липкими" кінцями. В процесі дії ферментуна ДНК, тобто в процесі реасоціації молекули ДНК з утворенням водневих зв'язків між комплементарними основами можуть утворюватися різні комбінації фрагментів, у тому числі і кінцева структура, що містить вектор і пошуковий фрагмент чужорідної ДНК. Обробка лігазою створює ковалентно замкнуте кільце. Після трансформації і посіву на селективне середовище відбирають колонії, які несуть гібридну плазміду

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Тема 4-5: Основи генетичної інженерії	\|	Перспективи і проблеми біотехнології клонування генів

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.009 сек.