Теоретичні положення

Метод Коха – найбільш розповсюджений спосіб кількісного обліку мікроорганізмів на твердих середовищах. Сутність методу полягає в посіві визначеного об’єму досліджуваної суспензії мікроорганізму на тверде середовище в чашки Петрі і наступному підрахунку числа колоній, що виросли. При цьому приймають, що кожна колонія утворюється розмноженням однієї клітини.

Цей метод дозволяє вести облік тільки життєздатних мікроорганізмів. В аналізі беруть стерильно 1 мл суспензії і поміщають у 9 мл стерильної водопровідної води чи фізіологічного розчину, потім роблять ряд послідовних розведень (мал. 8.1).

Ступінь розведення перед посівом визначається передбачуваною кількістю мікроорганізмів в зразку. Ґрунт є середовищем заселення великого числа різноманітних мікроорганізмів. У 1 г ґрунту міститься від 1 до 10 млрд. клітин мікроорганізмів.

Рис. 8.1. Схема готування розведення і посіву суспензії мікроорганізмів

У лабораторній практиці мікробіології немає універсального живильного середовища, на якому розвивалися б усі ґрунтові мікроорганізми, тому результати загальної чисельності мікроорганізмів за методом висіву навіть на найбільш універсальні живильні середовища виходять заниженими.

Метод кількісного обліку мікроорганізмів за допомогою рахункових камер має обмежене застосування, пов'язане з тим, що в цьому випадку виконується облік усіх кліток мікроорганізмів без їхньої диференціації на живі й мертві клітини. Крім того, рахункові камери можуть бути використані лише для підрахунку щодо відносно великих об'єктів – клітин водоростей, дріжджів, спор, грибів, що можна дослідити методом мікроскопії з об'єктивами 8х–40х.

У випадку рухливості клітин препарат незначно підігрівають (чи додають краплю 0,1 % розчину агар-агару). Фіксація і фарбування препаратів призводить до деяких змін розмірів мікробних кліток.

Рахункова камера Горяєва являє собою товсте предметне скло з нанесеними на ньому поперечними прорізами, що утворюють три поперечно розташовані плоскі площадки (рис. 8.2). Середня площадка подовжнім прорізом розділена навпіл, причому на кожній половині нанесена квадратна сітка. Дві бічні площадки розташовано на 0,1 мм вище за середню. Ці площадки служать для притирання покривного скла. Сітка розділена на визначене число згрупованих великих і маленьких квадратів.

Постійною величиною у всіх сітках є маленький квадрат, сторона якого дорівнює 1/20 мм, площа його 1/400 мм², а об’єм при висоті камери 1/10 мм – 1/4000 мм³ чи 1/4000000 мл. Так званий великий квадрат складається з 16 малих квадратиків.

Камера Горяєва має площу 9 мм², об’єм камери – 9 мм³ і розбита на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 великих квадратів у кожнім ряду).

Рис. 8.2. Рахункова камера Горяєва:

А – вид зверху; Б – вид збоку; В – вид камери Горяєва з малим збільшенням мікроскопа.

Підрахунок кліток у камері починають через 3–5 хвилин після заповнення її, коли клітини осіли й розташувалися в одній площині. Підрахунок кліток ведуть звичайно в 10 великих або в 20 малих квадратах, переміщаючи її за діагоналлю. З вихідної суспензії варто приготувати 3–4 кратні розведення.

Порядок виконання роботи

1. Виконати посів за методом Коха суспензії зі зразка ґрунту, що розведений в 1000, 10000 раз на тверде вівсяне живильне середовище, МПА і середовище Гаузе. Результати інокуляції й підрахунок мікроорганізмів зробити на наступному занятті:

· наважку підготовленого ґрунту (1 г) поміщають у чисту ступку з невеликою кількістю стерильної води і розтирають гумовою маточкою чи пальцем у гумовій рукавичці приблизно 5 хвилин. Підготовлену суспензію переносять у колбу з 100 мл стерильної водопровідної води. Готують розведення ґрунтової суспензії, для чого 1 мл суспензії переносять послідовно в ряд пробірок з 9 мл стерильної водопровідної води;

· на поверхню твердого й підсушеного середовища наносять краплю ґрунтової суспензії визначеного розведення й за допомогою стерильного скляного шпателя розподіляють по всьому агару. Якщо висів проводять, починаючи з великих розведень, то використовують нову стерильну піпетку і новий шпатель для кожного розведення;

· засіяні чашки Петрі перевертають нагору дном і поміщають у термостат із визначеною температурою, яка сприятлива для розвитку мікроорганізмів, що враховуються;

· підрахунок колоній, що виросли, проводять через визначений час після посіву (3–5 доби). На МПА звичайно на 2–3 добу інкубації враховують спорові й безспорові форми бактерій. На середовищі Гаузе на 5–7 добу враховують колонії актиноміцетів, на сусло-агарі на 5–7 добу – колонії грибів і дріжджів;

· колонії, як правило, рахують, не відкриваючи чашки Петрі, у прохідному світлі. Для зручності дно чашки поділяють на сектори, підраховують кількість колоній у кожнім секторі, кожну відлічену колонію позначають крапкою (маркером) із нижньої сторони чашки Петрі й результати підсумовують. Для підрахунку колоній зручно користатися спеціальним приладом із лічильником;

· точність методу залежить від числа підрахованих колоній: кращим розведенням вважають те, у висіві якого на твердому живильному середовищі виростає від 50 до 150 колоній;

· підрахувавши кількість колоній на всіх паралельних чашках, обчислюють їхнє середнє число на одній чашці і потім роблять перерахування для визначення вмісту мікроорганізмів в 1 г ґрунту за формулою:

(8.1)

де N – кількість клітин у 1 г ґрунту; a – середня кількість колоній на чашці; b – розведення, із якого зроблено посів; c – кількість крапель у 1 мл суспензії.

2. Приготувати препарат із добової культури дріжджів роду Saccharomyces

і підрахувати кількість клітин у вихідній суспензії:

· мікробіологічною петлею краплю суспензії дріжджів наносять у центр рахункової камери. Рахункову камеру покривають покривним склом, ретельно притираючи його з країв до утворення ньютонівських кілець (кольорових смуг);

· підрахунок клітин дріжджів робити (із збільшенням мікроскопа: окуляр 10–15х, об'єктив 20–40х) у 20 малих квадратах, у 3–4 пробах досліджуваної суспензії. Загальне число підрахованих клітин мікроорганізмів повинне бути не менш 600, тому беруть 3–4 проби з досліджуваної суспензії для монтажу камери;

· потім розраховують середнє число мікробних клітин в одному малому квадраті і роблять перерахування на вміст у 1 мл вихідної суспензії за формулою:

(8. 2)

де N – число клітин у 1 мл суспензії; а – середнє число клітин у малому квадраті сітки; h – глибина камери в мм, s – площа малого квадрата сітки в мм²; n – розведення вихідної суспензії; 1000 – коефіцієнт перерахування мм³ у мл.

3. Провести дослідження мікрофлори повітря методом Коха. Цей метод заснований на седиментації, зв'язаний з осіданням бактеріальних клітин під впливом сили ваги на поверхню агару відкритої чашки Петрі. Він дає представлення в основному про якісний зміст мікроорганізмів. У залежності від поставленої задачі з дослідження мікрофлори повітря може проводитися як визначення загальної бактеріальної зараженості повітря, так і вивчення вмісту санітарно-показових мікроорганізмів, а також наявності патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів.

Для вивчення мікрофлори повітря зробити посів із повітря на МПА й СА живильні середовища у чашки Петрі.

Загальну кількість бактерій, що зустрічаються в повітрі, вираховують за ростом колоній мезофільних мікроорганізмів на МПА, проби відбирають на рівні подиху сидячої людини.

Чашки з МПА експонують 5–10–15 хвилин у залежності від передбачуваного бактеріального забруднення. Орієнтовно відповідно до перерахунку за Омелянським на поверхню 100 см²агару осідає за 5 хвилин така кількість бактерій, що міститься в 10 л повітря.

Результати всіх посівів розглянути на наступному занятті, та проаналізувати кількісний і якісний склад мікрофлори повітря з різних місць забору.

Лабораторна робота № 9

Тема: Дослідження культуральних властивостей мікроорганізмів. Перевірка чистоти культур

Мета: визначити характер росту мікроорганізмів на твердому живильному середовищі; описати отримані колонії мікроорганізмів, що засіяні на попередньому занятті; провести мікроскопічне дослідження мазків різних колоній, забарвлених за Грамом

Матеріали й устаткування: колонії мікроорганізмівна твердих середовищах у чашках Петрі, мікробіологічні пробірки зі стерильним скошеним сусло-агаровим середовищем, МПА, вівсяним агаром, спиртівка (брикети сухого пального), мікробіологічна петля, мікроскоп МБР, предметні і покривні стекла, барвники для фарбування за Грамом – генціанвіолет, фуксин, розчин Люголя, 96 % -ний спирт, пробірки, поплавці, (трубочки діаметром 5–7 мм, довжиною 35–45 мм, запаяні з одного кінця), ваги, пептон, К₂НРО₄, агар, індикатор бромкризолпурпур чи бромтимолблау (1,6 % -ний спиртовий розчин), вуглеводи (глюкоза, лактоза, маніт, сахароза й ін.)

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Виділення чистих культур за методом Коха	\|	Теоретичні положення

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.005 сек.