Іммобілізація ферментів. Мета і методи іммобілізації

Під іммобілізацією ферменту розуміють включення його в будь-яку ізольовану фазу, яка відділена від фази вільного розчину, але здатна обмінюватися молекулами субстрату або ефектора, що знаходяться у фазі вільного розчину. Іншими словами — іммобілізація — це включення ферменту в таке середовище, в якому доступною для нього є лише обмежена частина загального об'єму.

Іммобілізований фермент (лат. Immobilis — нерухомий) — це фермент, приєднаний тим чи іншим способом до інертної, нерозчинної підкладки або носія (матриці) з частковим або повним збереженням його каталітичної активності.

Іммобілізованим вважають також фермент, вміщений у сіткоподібну матрицю, крізь яку вільно проникають низькомолекулярні субстрати і продукти ферментної реакції, але не можуть пройти макромолекули білка-ферменту.

При іммобілізації обмежується рухливість молекул і відбувається закріплення структури таким чином, що активний центр ферменту зберігає свою каталітичну активність протягом тривалого часу.

Метою іммобілізації є можливість використання ферментних препаратів як промислових каталізаторів у біотехнологічних процесах одержання біотехнологічної продукції, для аналітичної роботи і в лікувальних цілях.

В результаті поєднання ферменту з носієм були створені гетерогенні біокаталізатори, для яких нещодавно, на першій конференції з інженерної ензимології в Хеннікері (США) в 1971 р. був узаконений термін «іммобілізовані ферменти». В літературі ще можна натрапити й на інші терміни, наприклад: «нерозчинні ферменти», «матрицьовані ферменти» тощо, зміст яких однозначний - це препарати ферментів, зв'язаних з нерозчинними носіями. Однак поняття іммобілізація потрібно розглядати ширше, як будь - яке обмеження вільності руху білкових молекул (або їх фрагментів) у просторі. Цього можна досягнути, окрім зв'язування з нерозчинним носієм, шляхом внутрішньомолекулярної чи міжмолекулярної «зшивки» білкових молекул низькомолекулярними біфункціональними реагентами, або приєднанням ферменту до розчинного полімеру. Такі препарати називають ферментами, модифікованими «зшиваючими» або, відповідно, полімерними реагентами.

Іммобілізовані ферментні препарати мають низку суттєвих переваг при використанні їх з прикладною метою порівняно з нативними попередниками.

По-перше, при іммобілізації ферменти з розряду гомогенних каталізаторів (які знаходяться у тій самій фазі, що й субстрати реакції) переходять у розряд гетерогенних (які утворюють особливу фазу, відділену від реагентів). Фермент і реагенти завдяки цьому можуть бути розділені. Це дає можливість: а) зупинити в потрібний момент реакцію; б) регенерувати фермент після закінчення реакції і використати каталізатор повторно; в) одержати продукт, незабруднений ферментом, що дуже важливо в харчовому і фармацевтичному виробництві.

По-друге, використання гетерогенних каталізаторів дозволить проводити ферментативний процес безперервно, наприклад, у проточних колонках, і регулювати швидкість реакції, що каталізується, а також вихід продукту шляхом зміни швидкості потоку.

По-третє, іммобілізація або модифікація ферменту сприяє цілеспрямованій зміні властивостей каталізатора, в тому числі і його специфічності, залежності каталітичної активності від рН, іонної сили розчину, температури й інших параметрів середовища, а також підвищує стійкість (або стабільність) до різних денатуруючих факторів у 100-1000 разів.

По-четверте, іммобілізація ферментів дає можливість регулювати їх каталітичну активність шляхом зміни властивостей носія.

Завдяки одержанню нового класу біоорганічних каталізаторів — іммобілізованих ферментів — стало можливим налагодження промислового крупнотоннажного виробництва біотехнологічної продукції, яке піддається автоматизації.

Метод іммобілізації також дає можливість одержувати препарати пролонгованої і направленої дії для застосування з лікувальною метою у гуманній і ветеринарній медицині та у тваринництві для поліпшення травлення і засвоєння поживних речовин кормів у організмі тварин та збільшення їх продуктивності.

Методи іммобілізації клітин мікроорганізмів умовно можна розділити на три типи: фізичні, механічні і хімічні (рис. 6.1), але частота використання їх різна.

Фізичні методи. До них належать адсорбція і агрегація.

Адсорбція є одним із найбільш традиційних способів іммобілізації клітин. Як адсорбенти (носії) можуть використовуватись різні органічні і неорганічні носії — різні природні мінерали (пісок, глини, дерев'яна стружка тощо) і синтетичні матеріали (кераміка, капрон, поліуретан та ін.). Останнім часом особливої уваги заслуговують крупнопористі носії. Однак цей спосіб, маючи низку суттєвих переваг (низька вартість, простота іммобілізації, відсутність дифузних затруднень і екологічність), містить чимало недоліків, які обмежують сферу застосування крупнопористих носіїв. Головна із них — це незначна адгезія мікроорганізмів.

Рис. 6.1. Основні методи іммобілізації клітин

(Н.Г. Рибальський, І.Г. Чапліна, 1990)

Агрегація. Цей метод полягає у зв'язуванні клітин між собою з утворенням агрегатів. Він рідко використовується в біотехнологічних процесах.

Механічні методи. Методи включення клітин у різні гелі одержали найбільше розповсюдження. Для цього найчастіше використовується поліакриламідний гель, карагенан, альгінатні гелі, а також фотопоперечнозшиті й уретанові полімери. Клітини, включені в поліакриламідний, Са-альгінатний і карагінановий гелі, можуть зберігати життєздатність і за присутності поживного середовища розмножуватись у приповерхневих шарах гелю.

Залежно від властивостей носія і характеру процесу використовують носії у вигляді гранул, волокон або мембран.

Мікрокапсулювання є одним з традиційних методів іммобілізації і останнім часом набуває широкого розповсюдження для іммобілізації клітин.

Хімічний метод. Він ґрунтується на утворенні ковалентних зв'язків з активованим носієм, на поперечній зшивці клітин за рахунок активних груп амінокислот та інших сполук у стінці клітин з біфункціональними реагентами, наприклад глутаровим альдегідом.

Хімічні методи іммобілізації клітин не знайшли такого широкого розповсюдження, як для іммобілізації ферментів та інших біологічно активних речовин. Це пов'язано, в першу чергу, з токсичною дією на клітини різних біфункціональних реагентів, хоча останнім часом з'явились різні методи, які зменшують токсичну дію реагентів, що дає можливість підвищити життєдіяльність клітин.

В останні роки запропонований абсолютно новий спосіб проведення ферментативних реакцій як для вільних, так і для іммобілізованих клітин — двофазові водно-органічні системи. Клітини при цьому локалізовані у водній фазі і меншою мірою зазнають впливу органічного розчинника, який не змішується з водою.

Японські дослідники розробили спосіб іммобілізації клітин у фоточутливі полімери. Іммобілізовані таким чином клітини є особливо прийнятними для використання двофазових систем і перетворення стероїдних сполук. Однак цей метод не підходить для живих клітин, але дає гарні результати при проведенні одностадійних реакцій.

Читайте також:

<== попередня сторінка	\|	наступна сторінка ==>
Іммобілізація біологічно активних речовин та клітин	\|	Лекція 6. Професійна пригодність та професіоналізм

Не знайшли потрібну інформацію? Скористайтесь пошуком google:

Генерація сторінки за: 0.006 сек.